運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)慢性心力衰竭大鼠壓力反射功能的影響及機(jī)制

慢性心力衰竭（chf）是一種臨床綜合征，具有通過心臟泵血功能減退而特點(diǎn)的低血壓。心衰初期,心輸出量降低,導(dǎo)致血壓下降,對(duì)動(dòng)脈壓力感受器刺激減弱,反射性引起交感神經(jīng)活動(dòng)增強(qiáng),外周血管收縮,提升血壓,代償心功能降低。因此,動(dòng)脈壓力反射(baroreflex,BR)功能減弱是心衰早期的代償反應(yīng)。但是,持續(xù)的壓力反射功能減退引起長(zhǎng)時(shí)間外周血管收縮,外周阻力增加,則促使心功能惡化,最終進(jìn)入失代償階段。研究表明,壓力反射功能降低增加心衰患者的死亡率,預(yù)示著不良預(yù)后。除了神經(jīng)因素外,心衰時(shí)細(xì)胞因子、內(nèi)分泌激素等體液因素也激活,尤其是血漿血管緊張素II(angiotensinII,AngII)升高,明顯抑制壓力反射功能,靜脈注射AngIIⅠ型受體(AT1R)拮抗劑losartan顯著改善心衰動(dòng)物的壓力反射功能。越來越多的研究顯示,壓力反射調(diào)節(jié)中樞,如孤束核、延髓頭端腹外側(cè)區(qū)、下丘腦室旁核等處,AT1R表達(dá)在心衰大鼠和家兔均增強(qiáng),側(cè)腦室應(yīng)用losartan能恢復(fù)受抑的壓力反射功能。上述研究提示,腦內(nèi)AngII是介導(dǎo)心衰時(shí)壓力反射功能減退的重要機(jī)制。近20年來,運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練(exercisetraining,EX)在防治心血管疾病中的作用逐漸得到重視。在西方國(guó)家,運(yùn)動(dòng)療法正逐步應(yīng)用于高血壓、慢性心衰及糖尿病等心血管疾病的康復(fù)治療。EX能明顯改善心衰患者的癥狀,提高生活質(zhì)量,降低心衰死亡率,但EX改善心衰的機(jī)制尚未完全闡明。有研究認(rèn)為EX通過增強(qiáng)迷走緊張性、降低交感神經(jīng)活動(dòng)增強(qiáng)心衰狀態(tài)下壓力反射功能,但也有相反的報(bào)道。因此,EX對(duì)壓力反射功能的影響仍有爭(zhēng)議。有報(bào)道EX降低心衰家兔血漿AngII并下調(diào)延髓頭端腹外側(cè)區(qū)AT1R表達(dá),但對(duì)其它腦區(qū)AT1R影響未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)將在心衰大鼠模型進(jìn)一步探討EX對(duì)壓力反射功能的影響及其可能機(jī)制。材料和方法1素、硝普鈉、at1r抗雄性SD大鼠,體重(180-220)g,由美國(guó)內(nèi)布拉斯加醫(yī)學(xué)中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供。苯腎上腺素、硝普鈉購自Sigma。AT1RⅠ抗、Ⅱ抗購自SantaCruz,ECL及BCA試劑盒(Pierce)。呼吸機(jī)(Harvard),UVP凝膠成像系統(tǒng)(Upland),生物信號(hào)采集和處理系統(tǒng)(PowerLab)。跑步機(jī)(Columbus)。冰凍切片機(jī)(Leica)2方法2.1手術(shù)組和對(duì)照組SD大鼠隨機(jī)分成心衰組(n=27)和假手術(shù)組(n=24)。心衰由結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支造成心肌梗死所引起,假手術(shù)組除不結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈外,其余步驟同心衰組。2.2運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練及坡度左冠脈結(jié)扎術(shù)后4周,2組大鼠再分成運(yùn)動(dòng)與非運(yùn)動(dòng)組,4組動(dòng)物為:心衰-運(yùn)動(dòng)(EX-CHF,n=13)、心衰-非運(yùn)動(dòng)(CHF,n=14)、假手術(shù)-運(yùn)動(dòng)(EX-sham,n=12)、假手術(shù)-非運(yùn)動(dòng)(sham,n=12)。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練采用動(dòng)物在跑步機(jī)(treadmill)跑步,1time/d,每周6d,共4周。為了使動(dòng)物產(chǎn)生耐受性運(yùn)動(dòng),運(yùn)動(dòng)時(shí)間從10min/d增加到60min/d,履帶速度從10m/min遞增至20-25m/min,跑道坡度從0%增至10%。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練結(jié)束后24h檢測(cè)比目魚肌檸檬酸合成酶活性,用于評(píng)價(jià)運(yùn)動(dòng)效果。2.3erlp-br壓力反射的調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練結(jié)束后24-48h,動(dòng)物在烏拉坦(800mg/kg)和α-氯醛糖(40mg/kg)麻醉下測(cè)定BR。左側(cè)頸總動(dòng)脈插管測(cè)定血壓,心率由脈搏波觸發(fā),血壓和心率信號(hào)輸入PowerLab信號(hào)處理系統(tǒng)。分離左側(cè)腎交感神經(jīng),置于雙極引導(dǎo)電極上,腎交感神經(jīng)放電(renalsympatheticnerveactivity,RSNA)及其積分信號(hào)也輸入PowerLab信號(hào)處理系統(tǒng)。測(cè)定BR時(shí),先靜脈注射硝普鈉,將動(dòng)物血壓降至50-60mmHg,緊接著靜注苯腎上腺素,血壓又升至150mmHg左右,反射性地引起RSNA逐漸減弱,甚至完全被抑制。將血壓變化和RSNA反應(yīng)作非線性回歸分析,即得到壓力反射調(diào)節(jié)RSNA功能曲線(簡(jiǎn)稱BR曲線)。BR測(cè)定后,動(dòng)脈導(dǎo)管從左頸總動(dòng)脈向左心室插入,測(cè)定左室舒張末期壓力。2.4免疫總蛋白水平BR功能測(cè)定后,動(dòng)物處死,迅速取出全腦,干冰速凍,-80℃保存。將腦做冠狀切片,在包含室旁核平面的下丘腦腦片上,用16號(hào)平針頭取下室旁核組織,2側(cè)組織塊放在一起作為1例樣本。組織樣本加入含蛋白酶抑制劑的裂解液,冰上勻漿、超聲破碎30s,4℃12000×g離心20min,收集上清液。BCA試劑盒測(cè)定上清液中總蛋白濃度,Westernblotting方法測(cè)定上清液中AT1R蛋白水平。Ⅰ抗為兔抗AT1(1∶2000稀釋),Ⅱ抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG1∶5000稀釋)。以GAPDH為內(nèi)參照,AT1/GAPDH的比值代表AT1R的蛋白表達(dá)量。2.5左室心梗面積計(jì)算每只動(dòng)物BR測(cè)定后處死,取出心臟,去除大血管、心房和右心室游離壁,沿室間隔縱向剪開左心室,攤平,用視頻掃描儀將整個(gè)左室面積(包括室間隔)掃描到電腦中,用SigmaScan軟件計(jì)算出左室總面積和心梗疤痕區(qū)面積,心梗面積=梗死區(qū)面積/左室總面積×100%。2.6低溫離心處理另外4組動(dòng)物在運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練結(jié)束后24h,烏拉坦麻醉下,頸總動(dòng)脈抽血2.5mL注入預(yù)冷的、含抗凝劑和酶抑制劑的試管,低溫離心(4℃3000r/min離心10min),分離血漿,-80℃貯存。采用[125I]放射免疫分析試劑盒(Buhlmann),按說明書進(jìn)行,γ計(jì)數(shù)器測(cè)定放射強(qiáng)度,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血漿AngII濃度。3統(tǒng)計(jì)處理數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,各組間比較采用雙因素方差分析(Two-wayANOVA),并進(jìn)行兩兩比較。結(jié)果1cs活性的比較骨骼肌檸檬酸合酶(citratesynthase,CS)活性是評(píng)價(jià)運(yùn)動(dòng)效果的常用指標(biāo),EX明顯增強(qiáng)兩組大鼠比目魚肌CS活性(P<0.01),見表1。雖然CHF組CS活性低于sham組,但EX-CHF組CS活性得到改善,接近于sham組。表1還顯示,EX不影響2組大鼠的血壓,但降低CHF大鼠心率和RSNA(P<0.01)。CHF大鼠心梗面積占左室總面積的(37.5±4.8)%,左室舒張末期壓力顯著高于sham組(P<0.01),EX對(duì)2組大鼠的心梗面積和左室舒張末期壓力無明顯影響。2br曲線斜率和最大增益CHF大鼠BR曲線的平均斜率(圖1A)和最大增益(圖1B)明顯小于sham組(P<0.01),但EX-CHF組斜率和最大增益較CHF組明顯增強(qiáng)(P<0.05),且與sham組相比無顯著差異;EX-sham組BR曲線斜率和最大增益與sham組相比,差異無顯著。這一結(jié)果提示,EX能恢復(fù)減退的壓力反射功能,對(duì)正常的壓力反射功能無明顯影響。3各組大鼠血漿angiii兩種方法,傳統(tǒng)粗隆壓藥,sham組圖2示CHF大鼠血漿AngII濃度較sham組升高近2倍[(263±55)ng/Lvs(92±21)ng/L,P<0.01),EX顯著降低CHF大鼠血漿AngII(137±27)ng/L,P<0.01,但仍高于sham組(P<0.01)。EX呈現(xiàn)降低sham組血漿AngII(75±17)ng/L的趨勢(shì),但EX-sham組與sham組相比,差異尚不顯著。4sham組與sham組at1r蛋白表達(dá)水平比較圖3顯示CHF大鼠下丘腦室旁核(paraventricularnuclei,PVN)AT1R蛋白水平顯著高于sham組(P<0.01),EX降低CHF大鼠AT1R蛋白水平(P<0.05),但對(duì)sham組大鼠AT1R蛋白表達(dá)無明顯影響。br功能曲線及與sham的比較運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練作為心衰的輔助治療在國(guó)外臨床應(yīng)用已20多年,但運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練改善心血管疾病的作用機(jī)制至今尚未完全闡明。動(dòng)脈壓力反射是維持循環(huán)功能穩(wěn)定最重要的神經(jīng)調(diào)節(jié),以負(fù)反饋方式抑制交感神經(jīng)活動(dòng)。本實(shí)驗(yàn)及其它研究均證實(shí),心衰時(shí)BR曲線的平均斜率和最大增益均低于假手術(shù)組,表明壓力反射功能減弱。有報(bào)道,持續(xù)的壓力反射功能減退引起交感神經(jīng)活動(dòng)長(zhǎng)時(shí)間增強(qiáng),外周血管收縮、外周阻力增加可促使心功能惡化。相反地,電刺激頸動(dòng)脈壓力感受器,加強(qiáng)壓力反射功能,則明顯提高心衰犬存活率,這一結(jié)果提示,增強(qiáng)壓力反射功能對(duì)阻止心衰發(fā)展至關(guān)重要。臨床觀察證實(shí),EX能有效降低心衰患者肌肉交感神經(jīng)活動(dòng)和血漿去甲腎上腺素以及抑制壓力反射的心交感神經(jīng)活動(dòng)。本實(shí)驗(yàn)顯示,EX顯著增強(qiáng)心衰大鼠BR曲線的斜率和增益,而且EX-CHF組BR功能曲線各參數(shù)與sham組、EX-sham相比,差異無顯著,這一結(jié)果表明,EX能使減退的壓力反射功能正?；?這與慢性心衰家兔運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后所觀察到的結(jié)果相一致。本實(shí)驗(yàn)觀察到,EX降低心衰大鼠升高的血漿AngII,提示降低的AngII與壓力反射改善存在某種關(guān)聯(lián)。Mousa等在實(shí)驗(yàn)中采用靜脈給藥方法將血漿AngII維持在高水平,EX則不能恢復(fù)心衰家兔壓力反射功能,這一結(jié)果有力證明了EX是通過降低血漿AngII改善心衰狀態(tài)下減退的壓力反射功能。但血漿AngII影響壓力反射弧哪一環(huán)節(jié)尚不清楚。神經(jīng)解剖學(xué)證據(jù)顯示,第三腦室室周器包括穹窿下器官(subforinalorgan,SFO)缺乏血腦屏障,能感受血液AngII變化,并將信息傳遞給PVN。PVN調(diào)節(jié)壓力反射的關(guān)鍵腦區(qū),壓力感受器傳入沖動(dòng)經(jīng)孤束核上行至下后腦PVN,PVN整合外周的傳入沖動(dòng)和大腦皮層、皮層下結(jié)構(gòu)的下行沖動(dòng)后,傳出纖維下行投射到延髓腹外側(cè)頭端,調(diào)控壓力反射功能。有研究顯示,心衰時(shí)孤束核、延髓頭端腹外側(cè)區(qū)和PVN等處AT1R蛋白表達(dá)上調(diào),EX降低心衰家兔延髓頭端腹外側(cè)區(qū)AT1R蛋白表達(dá)。本研究首次報(bào)道,EX下調(diào)心衰大鼠PVN內(nèi)AT1R蛋白表達(dá)。因此,降低的血漿AngII作用于下調(diào)PVN內(nèi)AT1R,解除AngII對(duì)壓力反射整合中樞的抑制作用,從而恢復(fù)受抑的壓力反射功能。骨骼肌CS活性是評(píng)價(jià)運(yùn)動(dòng)效能的常用指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)顯示,運(yùn)動(dòng)組(EX-CHF和EX-sham組)比目魚肌CS活性明顯高于非運(yùn)動(dòng)對(duì)照組,說明所采用的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練方案切實(shí)有效。雖然CHF大鼠比目魚肌CS活性低于sham組,但運(yùn)動(dòng)后EX-CHF