高毛霉mgc317發(fā)酵防腐劑發(fā)酵乳粉的研究

乳乳是由各種微生物（如水凝乳液）相互作用產(chǎn)生的一種酪氨酸產(chǎn)品。它充滿了水解蛋白、游離氨基酸、脂肪酸和硫酸鈉、鈣和磷的營養(yǎng)成分。因此,腐乳在豆制品中占有十分重要的位置。腐乳發(fā)酵包括前期發(fā)酵和后期發(fā)酵兩個(gè)發(fā)酵工藝。腐乳前期發(fā)酵往往是后期發(fā)酵成功的關(guān)鍵,為腐乳后發(fā)酵的色、香、味的形成提供準(zhǔn)備,整個(gè)后期發(fā)酵是大分子物質(zhì)降解與酯化成香的主要過程。在此期間,蛋白質(zhì)的水解程度被認(rèn)為是影響腐乳風(fēng)味、質(zhì)地的主要因素。在前期培菌時(shí)毛霉分泌的蛋白酶作用下,腐乳坯中大豆蛋白質(zhì)的質(zhì)構(gòu)已經(jīng)被破壞,腐乳坯變得柔嫩、充滿鮮味,組分易于消化吸收,營養(yǎng)效價(jià)增長。由于蛋白酶的作用,氨基酸含量及酸度大小也逐漸增加,其含量對腐乳的滋味和口感都有重要影響,而腐乳坯體的黏度大小與質(zhì)構(gòu)變化有密切關(guān)系,生產(chǎn)中常常用作為確定腐乳后期發(fā)酵成熟度的參考指標(biāo)。在前期研究的基礎(chǔ)上,筆者以高大毛霉菌株MHC-7和雅致放射狀毛霉M3118為標(biāo)準(zhǔn)對照,將雅致放射毛霉MGC317菌株接種豆腐坯進(jìn)行前期培菌和后期發(fā)酵,在不同發(fā)酵時(shí)間內(nèi)檢測蛋白酶活力、總酸含量、氨基酸態(tài)氮含量、粗蛋白含量及黏度的變化趨勢,以這5項(xiàng)指標(biāo)作為判定雅致放射毛霉MGC317菌株發(fā)酵性能的依據(jù),借以了解腐乳在后期發(fā)酵過程中的一些動(dòng)態(tài)變化,為完善腐乳的釀造機(jī)制,控制腐乳生產(chǎn)的成熟度和優(yōu)化腐乳發(fā)酵工藝提供一定的理論依據(jù)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株的篩選雅致放射狀毛霉MGC317菌株,貴州大學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存菌株;高大毛霉菌株MHC-7(以下簡稱“MHC-7”)和雅致放射狀毛霉M3118(以下簡稱“M3118”),購自四川省成都市調(diào)味品研究所和中國微生物菌種保藏中心,作為標(biāo)準(zhǔn)菌株。1.1.2一般原料豆腐坯、高粱酒(50度)、食鹽、香料、味精、辣椒面等購自花溪集貿(mào)市場。1.1.3儀器、儀器和測量方法恒溫培養(yǎng)箱,廣東省醫(yī)療器械廠;828型酸度計(jì),上海精密科學(xué)儀器有限公司;752型分光光度計(jì),尤尼柯(上海)儀器有限公司;LD4-2型離心機(jī),太倉市科教器材廠;NDJ-5S數(shù)字式黏度計(jì),深圳市金準(zhǔn)儀器設(shè)備有限公司;噴霧器,汕頭永盛噴霧器廠。1.1.4試劑和試劑均為分析純酪氨酸、福林酚試劑、三氯乙酸、甲醛、鹽酸、濃硫酸、硼酸、硫酸銅、硫酸鉀和氫氧化鈉試劑均購于重慶茂業(yè)化學(xué)試劑有限公司,以上試劑均為分析純。1.1.5培養(yǎng)基麩皮培養(yǎng)基:麩皮10g,水11mL,裝入250mL三角瓶中,攪拌,121℃滅菌20min后及時(shí)搖散備用。1.2方法1.2.1培養(yǎng)人組織碎屑法用75%的酒精將組織搗碎機(jī)的刀片及內(nèi)槽進(jìn)行消毒處理,然后將麩皮培養(yǎng)基中的菌絲取出放入組織搗碎機(jī)中,加入約3000mL無菌冷水進(jìn)行搗碎,然后用紗布過濾,即得孢子懸液。1.2.2提取劑為5.25ol/l的nacl溶液稱取混合均勻的腐乳湯料樣品,用等重量的0.15mol/L的NaCl溶液做提取劑,在水浴振蕩器中于25℃、120r/min條件下提取90min,過濾后備用。1.2.3生產(chǎn)工藝參照貴州省腐乳生產(chǎn)實(shí)際工藝及配方,采用瓶裝控溫發(fā)酵。1蛋白酶活力測定取一塊豆腐毛坯,刮下菌絲并收集,制備粗酶液,并測定蛋白酶活力。其工藝流程為豆腐坯→接種(MGC317、MHC-7、M3118)→培養(yǎng)(發(fā)花)→涼花→搓毛。2發(fā)酵于后期工藝流程為腌坯(食鹽)→裹輔料(鹵湯)→裝瓶→封口→后期發(fā)酵。用醬油調(diào)色至OD550為0.09～0.1,待用。1.2.4內(nèi)施天麻砂、陳皮、蘋果香料:花椒3g、八角1g、小茴香1g、砂仁0.3g、陳皮0.3g、草果0.3g。鹵湯:高粱酒9%、食鹽7%、香料1%、味精5%、辣椒面1%。1.2.5測定指標(biāo)及方法將毛霉MGC317、MHC-7和M3118菌株制備成孢子懸液,噴霧接種于豆腐坯上,培養(yǎng)2～3d后,鹽腌30h后洗胚,裝瓶發(fā)酵至成熟,在不同時(shí)間下測定以下指標(biāo),繪制各指標(biāo)含量變化曲線圖。1)蛋白酶活力參照福林酚法進(jìn)行測定;2)氨基酸態(tài)氮參照GB/T5009.39-2003甲醛值法進(jìn)行測定;總酸含量參照GB/T5009.40-2003NaOH滴定法進(jìn)行測定;粗蛋白參照凱氏定氮法進(jìn)行測定;黏度測定:取樣品10mL于燒杯中,用NDJ-5S數(shù)字式黏度計(jì)(選用4號轉(zhuǎn)子,12r/min)測定其絕對黏度,讀取絕對黏度的數(shù)值。1.2.6雜菌的培養(yǎng)將毛霉MGC317、MHC-7和M3118菌株孢子懸液,分別接種于豆腐坯上,發(fā)酵2～3d后,取出豆坯,撕開毛坯表面同一側(cè)的皮膜,用30mL無菌水沖洗表面,將此菌懸液適當(dāng)稀釋,分別取100μL涂于平板上,培養(yǎng)15h左右,通過平板計(jì)數(shù)和顯微觀察計(jì)算雜菌數(shù)量。2結(jié)果與分析2.1和標(biāo)準(zhǔn)曲線上的蛋白酶活力從表1看出,經(jīng)過12～66h的前期培菌,高大毛霉菌株MHC-7、雅致放射毛霉M3118和雅致放射毛霉MGC317在豆腐坯上產(chǎn)蛋白酶活力都比較高,48h時(shí)蛋白酶活力最大,達(dá)59.55～69.10U/mL,雅致放射毛霉MGC317尤其突出,為69.10U/mL。表明,此菌株的發(fā)酵性狀優(yōu)越于高大毛霉菌株MHC-7和雅致放射毛霉M3118。2.2發(fā)酵過程中總酸含量和酸度的變化從圖1看出,在腐乳后期發(fā)酵中,3個(gè)菌株產(chǎn)蛋白酶活力在0～20d時(shí)呈上升趨勢,隨后逐漸下降。說明,蛋白酶已經(jīng)將大部分的蛋白質(zhì)降解,發(fā)酵20～70d時(shí)酶活力降低,可能是有部分酶失活。從圖1還可看出,總酸含量隨著時(shí)間的延長呈逐漸增加的趨勢。后期發(fā)酵的60d后,酸度急劇增加。表明,在發(fā)酵過程中有較多酸性物質(zhì)生成。這與魯緋等的報(bào)道結(jié)果一致。由于發(fā)酵環(huán)境呈現(xiàn)缺氧狀態(tài),各種微生物相互作用,代謝產(chǎn)生大量酸性物質(zhì),使環(huán)境變?yōu)樗嵝浴?.3后期發(fā)酵階段從圖2看出,在前期鹽坯階段,3個(gè)菌株在接種后的培養(yǎng)過程中產(chǎn)生了大量的蛋白酶,蛋白酶將蛋白質(zhì)水解為氨基酸,因而在粗蛋白減少的同時(shí)游離氨基態(tài)氮的含量逐漸增多。在后期發(fā)酵階段,腐乳中的游離氨基態(tài)氮的含量隨著時(shí)間的延長而增多。據(jù)馬勇等研究,在腐乳后期發(fā)酵中,當(dāng)游離氨基態(tài)氮的含量大于0.5%時(shí),即可認(rèn)為腐乳已經(jīng)成熟。3個(gè)菌株發(fā)酵到70d左右相繼達(dá)到成熟。從圖2還可看出,在后期發(fā)酵階段,3種毛霉菌株發(fā)酵腐乳的蛋白含量呈下降趨勢。與余若黔等的研究結(jié)果相一致。這是由于前期培菌階段產(chǎn)生了大量的蛋白酶,在后期發(fā)酵階段蛋白酶將豆腐中的蛋白質(zhì)分解為小分子的物質(zhì),因而粗蛋白含量在后期發(fā)酵階段逐漸降低。2.4發(fā)酵過程中乳酸黏度的變化從圖3可知,在后期發(fā)酵的0～30d內(nèi)腐乳坯體黏度降低較快,而后變化緩慢。說明,腐乳的質(zhì)構(gòu)變化(即大豆蛋白質(zhì)的降解)主要發(fā)生在前30d內(nèi),也是腐乳口感形成的重要時(shí)期。在以后的發(fā)酵過程中,腐乳的黏度呈降低趨勢。這是由于在腐乳白坯的制作過程中,大豆蛋白質(zhì)在凝固劑的作用下發(fā)生了膠凝作用,形成了網(wǎng)狀的蛋白質(zhì)凝膠結(jié)構(gòu),具有很強(qiáng)的保水能力,表現(xiàn)為流動(dòng)性差、黏度高。經(jīng)過前期培菌和腌制,雖然毛霉分泌的蛋白酶對大豆蛋白質(zhì)有一定的降解作用,但凝膠結(jié)構(gòu)未受到較大破壞,鹽坯仍然表現(xiàn)出很高的黏度。隨著后期發(fā)酵的進(jìn)行,蛋白質(zhì)的凝膠結(jié)構(gòu)逐漸受到破壞,保水能力減弱,坯體黏度也隨之迅速降低,本階段是腐乳柔糯滑膩口感形成的重要時(shí)期,因而成熟的腐乳具有滋味鮮美、風(fēng)味獨(dú)特、質(zhì)地細(xì)膩的優(yōu)良品質(zhì)。2.5抗雜菌能力情況從表2看出,菌株MGC317抗雜菌能力較強(qiáng),雜菌數(shù)為23株。而高大毛霉菌株MHC-7和雅致放射狀毛霉M3118(對照菌株)抗雜菌能力相對較弱,分別為34株和40株。可能是由于菌株MGC317在發(fā)酵過程中總酸含量較標(biāo)準(zhǔn)株明顯增高以及產(chǎn)生某些次生代謝產(chǎn)物抑制了雜菌的生長,對實(shí)現(xiàn)純種發(fā)酵、縮短腐乳后熟期以及提高腐乳的安全性具有較高的參考意義。3結(jié)果測定指標(biāo)1)游離氨基酸的含量與腐乳的鮮味密切相關(guān),MGC317菌株在發(fā)酵過程中具有較高的蛋白酶活力和氨基酸態(tài)氮含量,以及總酸含量較高等特點(diǎn),因而賦予了腐乳味鮮的特點(diǎn),同時(shí)也可以作為判斷成熟程度的參考指標(biāo)。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),該菌株在培菌階段菌絲平均長度為3.1cm,比對照菌株MHC-7和M3118長,菌絲完全包被乳坯時(shí),菌體