大豆發酵發酵及其中毛霉氨肽酶的分離純化

毛霉菌是腐敗發酵的主要細菌之一。在腐殖生產中，它主要是通過消化和分析酶來分解豆腐胚胎中的大豆蛋白。腐乳成品中的蛋白質主要是以多肽形式存在,具有相當高的水解程度,已經從中分離出多種具有生理活性的多肽。對眾多腐乳產品的感官分析表明,腐乳產品通常不具有一般蛋白水解物所特有的苦味。因此毛霉蛋白酶在解決植物蛋白(尤其是大豆蛋白)水解率低、水解產物具有強烈的苦味等難題方面具有很大的潛力。目前行業內僅有少數學者對毛霉的發酵產酶特性以及粗酶的催化、水解特性進行過探討。然而,毛霉由于長期受到高蛋白環境條件的馴化,它通常具有合成及分泌多種胞外蛋白酶的能力,其胞外的蛋白酶系是由多種蛋白酶所構成的復雜體系,因此,單純從總體上(即粗酶的研究)并不能完全了解其內在的特性。為全面了解這一蛋白酶系的組分構成、各組分的催化特性以及相互之間的作用,課題組開展了相關的研究。在前期的工作中,對毛霉胞外的內肽酶組分進行了分離純化及性質分析,并考察了它們對大豆蛋白的水解特性。結果表明,毛霉胞外主要有3個內肽酶組分,包括一個堿性蛋白酶和兩個酸性蛋白酶,堿性蛋白酶與酸性蛋白酶之間有一定的肽鍵選擇互補性,兩者共同作用于大豆蛋白可以實現大豆蛋白的深度水解。然而,感官分析卻發現,大豆蛋白的毛霉內肽酶水解物也有強烈的苦味。由此看來,在毛霉胞外可能存在一些具有脫苦效果的蛋白酶組分,為此,我們對毛霉胞外的氨肽酶組分進行了分離純化并對其性質進行了研究。1材料和方法1.1其他蛋白及氨基酸雅致放射毛霉ActinomucorelegansAS3.2778(發酵工程實驗室保藏菌種);DEAE-Sepharosee、Phenyl-Sepharose、SephadexG50購自Pharmacia公司;苯甲基磺酰氟(PMSF)、EDTA、E-64、Pepstatin,購自Amersco公司;Gly-Pro-pNA、Gly-pNA、Pro-pNA、Arg-pNA、Leu-pNA、Val-pNA等,購自Sigma公司;大豆分離蛋白(SPI,蛋白質量分數為87.35%),購自哈爾濱高科大豆食品有限公司;Alcalase蛋白酶,購自Novo公司;其他試劑均為分析純或生化試劑。1.2測試方法1.2.1酶活單位的測定采用Folin-酚法。1.5mL離心管中加入0.3mL適當稀釋的酶液及0.3mL1.5%酪蛋白(溶于0.05mol/LpH5.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液),40℃反應l0min,再加0.6mL0.4mo1/L的三氯乙酸終止反應,靜置15min后14000×g離心10min,取上清液0.6mL,加入3mL0.4mol/LNaCO3溶液及0.6mL福林酚試劑,于40℃顯色20min,于680nm測其吸光值,根據標準曲線計算酶活單位。1.2.2酶解履行的測定150μL酶液加入150μL0.2mmol/LL-脯氨酸-對硝基苯胺,混勻后置于35℃水浴反應20min,沸水浴滅活3min。然后用微量比色皿測定405nm吸光度。以150μL滅活的酶液加150μL0.2mmol/LL-脯氨酸-對硝基苯胺作為空白對照。根據標準曲線計算酶活。酶活定義:實驗條件下,每分鐘水解L-脯氨酸-對硝基苯胺(Pro-pNA)產生1μg對硝基苯胺所需酶量即為1個酶活單位。1.2.3粗酶液的提取稱取一定量干麩曲(發酵方法見文獻)加入10倍體積的0.3mol/LNaCl溶液,混勻后于30℃水浴中抽提1.5h,紗布過濾后在4℃,7000×g離心10min,取上清液即得到粗酶液。1.2.4毛霉氨酸酶的純度1.2.4.u3000乳化取一定體積的粗酶液,在冰水浴上緩慢加入固體(NH4)2SO4到飽和度為50%,充分溶解后在4℃冰箱中靜置4h,于4℃,12000×g離心20min,取上清液繼續加入固體(NH4)2SO4至飽和度為70%,4℃冰箱中靜置12h,然后于4℃,12000×g離心20min,蛋白沉淀用0.02mol/L,pH值7.5的Tris-HCl緩沖液溶解,并透析脫鹽。1.2.4.鹽析脫鹽緩沖液的提取用0.02mol/L,pH7.5的Tris-HCl緩沖液平衡DEAE-Sepharose陰離子交換柱(3.0cm×30cm),取一定量鹽析脫鹽后的酶液,加樣陰離子交換柱。用平衡緩沖液充分洗柱后,用A液:0.02mol/L,pH7.5的Tris-HCl緩沖液;B液:0.5mol/LNaCl溶液(溶于0.02mol/L,pH7.5的Tris-HCl緩沖液)進行階梯等度洗脫,流速1.5mL/min,收集50%B階梯洗脫蛋白峰,然后用超濾離心管濃縮收集液。1.2.4.phenyl-酶染色及等度洗脫用1.2mol/L(NH4)2SO4溶液(溶于0.05mol/L,pH7.5的PBS緩沖液)平衡Phenyl-Sepharose疏水層析柱(1.6cm×20cm)。將上一步收集的濃縮酶液與2.4mol/L(NH4)2SO4溶液(溶于0.1mol/L,pH7.5的PBS緩沖液)等體積混和后加樣Phenyl-Sepharose疏水層析柱,用平衡緩沖液充分沖洗疏水柱,然后用A液:0.05mol/L,pH7.5的PBS緩沖液;B液:1.2mol/L(NH4)2SO4溶液(溶于0.05mol/L,pH7.5的PBS緩沖液)進行階梯等度洗脫,流速1.0mL/min。收集60%B階梯洗脫蛋白峰(即脯氨酸氨肽酶蛋白峰)。1.2.4.濃縮酶液的制備用0.02mol/L,pH7.5PBS緩沖液平衡SephadexG50凝膠柱(1.6cm×100cm),分別加樣1.2.4.2和1.2.4.3的濃縮酶液,用0.02mol/L,pH7.5的PBS緩沖液洗脫,流速0.5mL/min。收集活性蛋白峰,用超濾離心管濃縮收集的樣品。1.2.5毛霉氨酸酶的催化劑性質1.2.5.毛霉氨肽酶活性測定按照氨肽酶活性測定方法,分別以Gly-Pro-pNA、Gly-pNA、Pro-pNA、Arg-pNA、Leu-pNA、Val-pNA等為底物,測定毛霉氨肽酶對不同底物的水解活性。1.2.5.溫度對毛霉氨肽酶活性的影響按照酶活測定方法分別于不同的溫度(30～70℃)下測定毛霉氨肽酶的活性,考察溫度對毛霉氨肽酶活性的影響。根據實驗結果繪制溫度-活力曲線,并由此確定毛霉氨肽酶的最適作用溫度。1.2.5.ph對毛霉氨肽酶活性的影響按照酶活測定方法分別于不同pH緩沖條件下(pH3.0～5.0,0.05mol/L乙酸緩沖鹽;pH6.0～7.0,0.05mol/L磷酸緩沖鹽;pH8.0～9.0,0.02mol/LTris-HCl;pH9.5～10.5,0.02mol/Lglycine-NaOH)測定毛霉氨肽酶的活性,考察pH對毛霉氨肽酶活性的影響。根據實驗結果繪制pH-活力曲線,并由此確定毛霉氨肽酶的最適作用pH范圍。1.2.5.溫度對氨肽酶穩定性的影響在氨肽酶的穩定pH條件下,將酶液分別于不同溫度(30～70℃)下保溫30min,測定保溫前后氨肽酶活性的變化,考察溫度對氨肽酶穩定性的影響。以酶活殘留率對溫度作圖,繪制氨肽酶熱失活曲線。1.2.5.酶活殘留率測定用不同的緩沖液分別調節酶液的pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0,于25℃放置約1h,測定放置前后酶活,計算酶活殘留率。以酶活殘留率對pH值作圖,繪制氨肽酶的pH穩定曲線。1.2.5.抑制劑混和對氨肽酶活性的影響在酶的穩定pH值條件下,將酶液與不同類型的抑制劑混和,25℃下放置約30min,測定加入抑制劑保溫后氨肽酶的活性。考察抑制劑對氨肽酶活性的影響。1.2.5.7金屬離子對酶活性的影響在酶的穩定pH值條件下,將酶液與不同的金屬離子溶液混和,于室溫中放置30min后測定酶活,比較各種金屬離子對氨肽酶活性的影響。1.2.6alcarlo酶解法用蒸餾水配制5g/100mL大豆分離蛋白,用1mol/LNaOH調節pH至pH值11.0,置于90℃恒溫水浴中預處理15min,冷卻后按酶活與底物比為3000u/g加入Alcalase堿性蛋白酶,置于50℃的水浴中保溫酶解5h。水解結束后直接加熱煮沸,并趁熱過濾,濾液冷凍干燥,即得到大豆多肽樣品。1.2.7硫酸奎寧溶液110以硫酸奎寧為標準對照物,采用感官分析的方法對大豆多肽的苦味進行了評價,大豆多肽苦味強度以具有相同苦味的硫酸奎寧摩爾濃度表示。配制一定摩爾濃度的硫酸奎寧溶液,分別稀釋到10-4、10-5、10-6、10-7、10-8mol/L,對應的苦味強度分別為:強、較強、中、弱、無。感官評定小組由8人組成,評定人員用蒸餾水漱口后,取待測水解液3～5mL置于口中,10s后吐出,漱口后取與之苦味程度相近的標準液品嘗,如確認兩苦味相近,即可把待測水解液定義為該標準液的苦味值,否則取其他標準液品嘗,直至確定其苦味值。1.2.8大豆多肽的風險氧化用pH6.5,0.02mol/L磷酸鹽緩沖液配制3%大豆多肽溶液,按氨肽酶酶活與底物比為3000u/g加入純化后的氨肽酶,置于35℃水浴保溫3h,每隔一定時間取樣進行苦味感官分析。2結果與分析2.1分離和純化氨肽酶的活性采用層析的方法對毛霉胞外的氨肽酶進行了初步的分組分離及純化。首先,采用DEAE-Sepharose陰離子交換層析對鹽析后樣品進行了初步的分離純化,通過對其洗脫方法進行優化,最終使氨肽酶組分完全集中在50%B的洗脫峰(如圖1示),并實現了內肽酶與氨肽酶的分離,同時使氨肽酶得到了濃縮;然后,采用疏水層析的方法對上一步收集的氨肽酶樣品做進一步的分離(如圖2),結果發現在疏水層析中可以分離得到2個有活性的洗脫峰,即60%B洗脫峰(活性峰1)和20%B洗脫峰(活性峰2),據此可以初步確定,毛霉胞外至少有2個不同的氨肽酶組分;相比而言,峰1的氨肽酶活性要強得多,峰2僅為其活性的30%左右;最后,采用凝膠層析的方法對疏水層析收集的活性峰1進行了進一步的純化(如圖3),并同時對樣品進行脫鹽處理。通過以上一系列的純化操作,雖然可以實現內肽酶與氨肽酶的分離,2個氨肽酶組分之間也得以分開,氨肽酶的純度有所提高,但是最終并不能完全純化出目標蛋白。純化得到的氨肽酶樣品中仍然含有一定量的雜蛋白。因此,對毛霉氨肽酶的純化還需考慮其他的方法。2.2毛霉氨肽酶活性毛霉氨肽酶對不同底物的水解活性如表1所示。毛霉氨肽酶對不同底物的水解活性顯示出一定的差異。總的來看,毛霉氨肽酶主要對小肽N端疏水性氨基酸,如Pro、Leu、Ile、Phe構成的肽鍵有很強的水解活性;而對小肽N端非疏水性氨基酸,如Arg、Ala、Gly構成的肽鍵水解活性非常弱,甚至無水解活性。比較毛霉氨肽酶對表中底物的水解活性來看,該氨肽酶對Pro-pNA有最大的水解活性,是一脯氨酸氨肽酶。2.3白酶抑制劑抑制酶活性抑制劑及金屬離子對毛霉氨肽酶活性的影響見表2。結果表明,在所試驗的幾種蛋白酶抑制劑中,僅1mmol/L的PMSF對氨肽酶有部分抑制作用,但不能完全抑制其活性。由此說明,毛霉氨肽酶可能是一種絲氨酸蛋白酶,但其催化特性及結構不同于一般的絲氨酸蛋白酶;常見金屬離子對毛霉氨肽酶活性的影響不明顯。2.4ph值對活性的影響pH值對毛霉氨肽酶活性及穩定性的影響如圖4所示。與毛霉內肽酶相比,毛霉氨肽酶的pH-活性曲線相對較窄,pH值對其活性的影響非常顯著。毛霉氨肽酶在pH值6.5左右有最大催化活性,而在pH值5.0時,氨肽酶的活性僅為最大活性的50%左右。此外,毛霉氨肽酶在中性附近(pH值5.0～8.0)有相對較好的穩定性,當pH值低于5.0時該氨肽酶會迅速的變性失活。2.5溫度對其催化活性的影響溫度對毛霉氨肽酶活性及穩定性的影響如圖5所示。在相對較低的溫度(25～45℃)下,毛霉氨肽酶活性隨溫度的升高變化的幅度較平緩;當溫度超過45℃后,酶活會迅速下降;該氨肽酶在40～45℃的范圍內有最大催化活性,然而其在25℃下也顯示出相對較高的活性,約為最大活性的50%,這可能與該酶相對較低的熱穩定性有一定的關系。由于在相對較低的溫度(25～45℃)下,酶已經有一定程度的失活,因此表現出溫度升高對促進反應速度的加速效應不顯著。圖5B的結果確實顯示,毛霉氨肽酶的熱穩定性相對較差,其在30℃以內有較好的穩定性,當溫度超過40℃酶會迅速失活。例如,在40℃保溫30min后,酶活大約有10%的損失;在50℃保溫30min后,酶活完全喪失。2.6脫苦處理大豆多肽的處理對其活性氨基酸的影響純化的毛霉氨肽酶對大豆多肽的脫苦效果如圖6所示。毛霉氨肽酶對大豆多肽有顯著的脫苦效果,隨著脫苦反應的進行,大豆多肽的苦味逐漸減弱并最終消除。在氨肽酶脫苦的初期,大豆多肽的苦味變化極為顯著;初始3%的大豆多肽溶液有很強烈的苦味,用氨肽酶脫苦處理0.5h后,其苦味明顯減弱為中等強度;脫苦處理1h后,其苦味已非常弱(略有微弱的苦味);脫苦處理3h后,