阿膠中水溶性成分凝膠排阻色譜分析方法研究

經過加工的聚吡咯動物驢皮（quusasinusl）的皮。藥用歷史已有2000多年,從古至今,一直作為滋陰潤燥﹑補血止血的良藥。其主要成分為膠原蛋白部分水解產生的多肽、多種氨基酸、金屬元素及硫酸皮膚素、生物酸等。2005年版中國藥典采用定氮法測定總氮量以控制阿膠的質量,該方法測定的總氮量包括有機氮和無機氮,方法粗放,專屬性不強。為增強阿膠質量的可控性,作者建立了柱前衍生化HPLC法測定阿膠中羥脯氨酸及膠原蛋白的主要水解氨基酸甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸含量的方法。該方法準確、可靠,具有良好的重復性和穩定性。然而,該方法測定的是阿膠水解后的氨基酸,不足以反映組成阿膠的蛋白質類成分的原生狀態。為此,本文研究建立了阿膠中水溶性成分凝膠排阻色譜分析方法(gelexclusionchromatography,簡稱GPC法),不經水解直接分析阿膠中的可溶性蛋白質及多肽的相對分子質量分布規律,并比較16個企業40批產品的差異,以期更客觀、科學地評價阿膠的質量情況。1樣品及試劑的制備Agilent1100高效液相色譜儀;實驗樣品阿膠為2007年對不同生產廠家進行藥品評價性抽驗留樣的樣品(見表1)。相對分子質量標記物β-淀粉酶(批號:054k6104)購自Sigma公司,胰島素(批號:0633-200703)由中國藥品生物制品檢定所提供,均為供含量測定用。試劑磷酸氫二鈉、氫氧化鈉均為分析純;純凈水為Milli-Q純水。2流動相及檢測波長色譜柱為TSK-GELG4000PWXL(7.8mm×300mm,平均孔徑500?),柱溫為室溫(25℃),流動相為0.05mol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH=7.2)(取磷酸二氫鈉27g,加水使溶解成1000mL,取50mL,加0.2mol·L-1氫氧化鈉溶液約40mL,再加水稀釋至200mL,即得),流速為0.4mL·min-1,檢測波長為280nm。3溶液制備3.1標準溶液3.2試驗溶液4分析的證實4.1系統適應性和專業試驗4.2精密度測試4.3重復試驗5樣品類別及含量特征按上述條件,以β-淀粉酶(相對分子質量約2.15×105)和胰島素(相對分子量約5.7×103)作為相對分子質量標記物,對16個不同企業生產的40批阿膠樣品測定,結果見圖2。結果發現,阿膠含有的蛋白質及多肽的相對分子質量主要集中在6×103~2×105。為便于分析,將色譜圖中的保留時間為16~32min之間的區域稱為A區;將主峰頂端及其右半部分劃為B區。如圖1所示。B區的肩峰特征,以該區域中肩峰的高低及比例變化可將樣品大致分成2類。第1類為肩峰較低,且肩峰在該區域中所占比例較小,有A1~A3,B1~B3,C1、C2,D1~D3,E2,F1~F3,G1~G3,H1~H3,I1~I3,J2,N,來自11個企業的26批樣品;第2類為肩峰高,其在該區域中所占比例較大,有E1,E3,J1,J3,K1~K3,L1~L3,M1、M2,O,P,來自7個企業的14批樣品。觀察色譜圖A區的峰形特征,以該區域峰形曲線是否較對稱,又可將“3.1”所述第1類樣品大致分成2組。第1組為峰形較對稱,有A1~A3,B1~B3,C1、C2,D1~D3,來自4個企業的11批樣品;第2組為峰形對稱性差,有E1~E3,F1~F3,G1~G3,H1~H3,I1~I3,J2,N,來自7個企業的17批樣品。A區和B區的特征,將40批樣品大致分為三大類:第Ⅰ類為A區峰形較對稱,主峰右側肩峰較小,有A1~A3,B1~B3,C1、C2,D1~D3,來自4個企業的11批樣品;第Ⅱ類為A區中的峰形對稱性稍差峰頂部略向右偏移,但肩峰很小,有E1~E3,F1~F3,G1~G3,H1~H3,I1~I3,J2,N,來自7個企業的17批樣品;第Ⅲ類為A區峰形對稱性差,肩峰很大分別為J1,J3,K1~K3,L1~L3,M1、M2,O,P,來自6個企業的12批樣品。相對而言,不同企業間樣品差異較大,而同一企業的樣品相對變化較小。以上分析結果如圖3所示。4相對分子質量分析4.1凝膠排阻色譜法是近年來應用越來越廣泛的一種液相色譜技術。分離原理為凝膠色譜柱的分子篩機制。在填充劑親水凝膠表面分布著不同尺寸的孔徑,藥物分子進入色譜柱后,它們中的不同組分按其粒徑大小進入相應的孔徑內,粒徑大于凝膠孔徑的分子不能進入填充劑顆粒內部,在色譜過程中不被保留,最早被流動相洗脫出,表現為保留時間較短;小于所有孔徑的分子能自由進入填充劑表面的所有孔徑,在柱子中滯留時間較長,表現為保留時間較長;其余分子則按分子大小依次被洗脫。凝膠排阻色譜法常用于高分子化合物,如蛋白質、多肽、核酸等的分離分析。4.2通常認為,阿膠是由驢皮中的膠原蛋白(平均相對分子質量為12萬多)及其部分水解產物組成。阿膠熬膠的過程就是膠原蛋白肽鍵(-CO-NH-CO-)部分斷裂,形成一系列降解產物。溫度和時間適當,這些成分進一步水解,產生多肽,甚至是氨基酸。所以阿膠實際上是一種蛋白質、多肽、氨基酸的混合物。有人認為,正是阿膠制備過程中疏水性的膠原蛋白在溫度、水分、時間的作用下變成“親水性膠體”,從而形成獨特的“聚負離子基”結構,與阿膠的藥效有關。連續系統聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS)電泳測定表明,阿膠的膠原蛋白分子是多分散體系,相對分子質量分布范圍相當寬,但多集中在相對分子質量6×103~1.2×105之間。也就是說阿膠蛋白質水解條件的強弱、水解程度的高低以及批間原料與工藝的一致性,直接影響阿膠成品蛋白質、多肽相對分子質量分布。應用本文建立的凝膠排阻色譜法,經反復實驗,選用相對分子質量已知的2個蛋白類物質β-淀粉酶(相對分子質量約2.15×105)和胰島素(相對分子質量約5.7×103)作為相對分子質量標記物,測得阿膠蛋白質及多肽的相對分子質量主要分布于二者之間。可認為阿膠蛋白質及多肽的相對分子質量集中在6×103~2×105,而非文獻報道的6×103~1.2×105與1.5×104以下。色譜圖B區域主要為阿膠生產過程中產生的相對分子量較低的多肽類物質。相對而言,峰形對稱性差、相對分子質量相對較小的成分比例大的樣品,生產工藝中水解條件較劇烈,水解程度較高。B區域中的肩峰大,提示其生產過程水解條件較劇烈,生產工藝參數也不穩定。另外,由圖2可見40批樣品保留時間約12.5min的色譜峰的大小有差異,這是相對分子質量較大的蛋白質,可反映不同企業,甚至同一企業批間原料或生產工藝有別。4.3主成分分析(principalcomponentsanalysis,簡稱PCA)為廣泛地用于分析化學信號處理的數據分析方法。為了能夠更客觀地分析阿膠樣品的差異,嘗試采用Thermo公司開發的TQAnalyst分析軟件,應用主成分分析法對16個企業的40批阿膠樣品進行圖譜分析,并以第一主成分PC1為X軸,第二主成分PC2為Y軸作相關聯圖(圖4)。從圖中各樣品的點分布情況看,40批樣品可明顯分為兩大區域:①和②。按照“3.2”項下方法劃分的第3類樣品全部落在區域①;有趣的是按照中國藥典2005年版標準檢驗不合格的樣品(L3、M1-2、P)都落在了這一區域。區域②又可進一步劃分為2個小區域:②-1和②-2,按照“3.2”項下方法劃分的第Ⅰ類樣品除樣品D3外都落在區域②-1中;第Ⅱ類樣品除樣品N外都落在區域②-2中。另外,從凝膠排阻色譜圖中可以看到多數廠家的3批樣品差別較小,說明其生產原料與工藝比較穩定,而企業J和L的3批樣品差異較大;這一結果在圖3中也客觀的反映出來。即主成分分析法和圖譜比對2種分析結果基本一致。4.4由A、B、C、D、E、F、G、H、I、K、L11個企業各3批阿膠樣品凝膠排阻色譜圖可見,除C企業外其余10個企業的3批樣品差別均較小,說明其生產原料與工藝比較穩定。文獻應用HPLC法研究東阿阿膠集團公司生產的10批阿膠中水溶性小分子成分,結果特征圖譜中的28個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%,提示同一企業生產的阿膠水溶性成分的相對含量較為穩定。與本文結論一致。4.5阿膠質量評價標準一直是藥學工作者關注的焦點,也是研究的難點。本文對阿膠水溶性成分的初步研究,獲得阿膠蛋白及多肽成分相對分子質量及其分布規律等關鍵信息,對進一步分離純化其單體成分及活性驗證實驗,以及建立更科學有效的阿膠質量標準提供重要支持。16個企業40批樣品的測定結果也提示為保證阿膠質量穩定,應該進行生產過程控制。4.6阿膠作為膠原蛋白分子多分散體系的動物膠類藥材的典型代表,其分散程度、規律以及與功效的相關性和檢測指標,值得深入研究。取β-淀粉酶、胰島素適量,精密稱定,加水制成每1mL分別含β-淀粉酶0.8mg、胰島素1.0mg的混合溶液。取阿膠樣品250mg,置于25mL量瓶中,加水約20mL,超聲處理(功率300W,頻率50kHz)30min,放冷,加水定容至刻度,搖勻,用微孔濾膜(0.45μm)濾過,即得。取標記物溶液、供試品溶液及空白溶液(水)各5μL,按“2.2”項下色譜條件進行測定,理論板數按胰島素計算為4034,分離度大于1.5,空白無干擾。信噪比(S/N)以b峰與噪音的比值計算為17。標記物溶液、供試品溶液凝膠排阻色譜圖見圖1