n端氨基酸序列測序研究進展

氨基酸序列的測定是了解蛋白質(zhì)性質(zhì)和功能的重要路徑。氮和氨基酸是重要的結(jié)構(gòu)和功能部位。序列具有很高的特異性。我們可以通過在n端少數(shù)氨基酸殘基中測定某些氨基酸。例如,可以通過對蛋白質(zhì)和多肽類藥物的N端進行人工修飾(如環(huán)化修飾、甲基化修飾等),提高其降解穩(wěn)定性延長藥效。因此N端肽段的鑒定具有非常重要的意義,本文對近年來蛋白質(zhì)和多肽N端測序技術(shù)及方法進行了綜述。1核心組蛋白的td-4/d定位與操作所有蛋白質(zhì)合成都起始于N端,其序列組成對其生物學功能有著巨大的影響。(1)蛋白質(zhì)的半衰期與N端氨基酸的特異性有關(guān),或者說N端氨基酸殘基對蛋白質(zhì)的壽命有控制作用;(2)N端序列與蛋白質(zhì)的亞細胞器定位有密切關(guān)系,例如,某些特殊的氨基酸序列可以作為蛋白質(zhì)分選標記影響蛋白質(zhì)定位;(3)蛋白質(zhì)的N端可發(fā)生許多種翻譯后修飾,影響其結(jié)構(gòu)和功能。如在新生肽鏈的成熟過程中,2/3的葉綠體蛋白質(zhì)會發(fā)生起始甲硫氨酸殘基的剪切和前導肽的去除;又如核心組蛋白N端賴氨酸的可逆乙酰化修飾使組蛋白與DNA間的作用減弱,導致染色體局部解旋,促進基因轉(zhuǎn)錄,而去乙酰化則抑制基因轉(zhuǎn)錄。這種乙酰化和去乙酰化過程中的任何異常都會導致生長、發(fā)育的紊亂,誘發(fā)白血病、皮膚癌等疾病。因此,通過對蛋白質(zhì)N端序列的研究有利于分析蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu),揭示蛋白質(zhì)的生物學功能。2蛋白質(zhì)和茶多酚n端測量技術(shù)2.1edan降解1955年,FrederickSanger采用二硝基氟苯(FDNB)法,首次成功地完成了第一個蛋白質(zhì)——牛胰島素的序列分析。在此測序方法的基礎(chǔ)上,瑞典有機化學家Edman提出了蛋白質(zhì)N端順序測定方法——Edman降解。之后隨著基于此原理的液相、固相及氣相自動蛋白質(zhì)序列分析儀的推出和逐步完善,經(jīng)典的Edman降解法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的N端測序。Chen等在微流控芯片上進行Edman反應(yīng),使得肽段測序的靈敏度提高到亞飛摩爾水平;并利用Edman反應(yīng)2次循環(huán)得到肽段的串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)圖的b2離子為內(nèi)標,獲得了更好的二級質(zhì)量準確度,實現(xiàn)了肽段快速、可靠的測序。但Edman降解方法受到以下諸多限制:(1)用于序列分析的蛋白質(zhì)或多肽必須是高純度的;(2)N端封閉的蛋白質(zhì)難以進行Edman反應(yīng),雖然出現(xiàn)了一些去除N端封閉基團的方法,例如用蛋白酶去除N端焦谷氨酸和通過酸催化的親核取代去除N乙酰化絲氨酸和N乙酰化蘇氨酸殘基等,但都只適于一定殘基的特定修飾,沒有普遍適用性,且許多末端殘基修飾是無法移去的;(3)不適于高通量分析,靈敏度不夠。但是Edman降解對于整體純化的蛋白的N端序列分析仍是很有價值的研究工具。人們還利用RT-PCR從編碼蛋白質(zhì)的mRNA得到其cDNA序列,再根據(jù)遺傳密碼表反推出其相應(yīng)的氨基酸序列。20世紀80年代出現(xiàn)了從基因組中找出編碼蛋白質(zhì)的基因,測定其DNA序列,再反推出蛋白質(zhì)的氨基酸序列的技術(shù)。其特點是更加簡便、快速,但利用RT-PCR或測定基因組的堿基序列也不能完全描述蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu),它對翻譯加工所導致的氨基酸殘基的修飾及突變等情況無能為力。2.2激光解吸放電-飛行時間技術(shù)的應(yīng)用質(zhì)譜(MS),尤其是電噴霧(electrasprayionization,ESI)和基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間(matrix-assistedlaserddesorption/ionizationtime-of-fight,MALDI-TOF)的出現(xiàn),使質(zhì)譜技術(shù)在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析中的應(yīng)用發(fā)生了革命性的飛躍。高靈敏度、高準確性、高分辨率和高通量的生物質(zhì)譜技術(shù)為蛋白質(zhì)的N端測序提供了一種重要的選擇。2.2.1氨基酸序列的確定是間接肽序列測定技術(shù),通過末端酶解或化學降解產(chǎn)生一組相互之間僅差一個氨基酸殘基的多肽系列,經(jīng)MALDI-TOFMS鑒定后,根據(jù)所得到的肽階梯圖中各肽段的相對分子質(zhì)量差值確定末端的氨基酸序列,從而用于數(shù)據(jù)庫查詢。階梯測序是最早探索用質(zhì)譜進行蛋白質(zhì)測序的例子,經(jīng)過幾個Edman反應(yīng)循環(huán)的肽段混合物被MALDIMS檢測,原始肽段的序列就可從質(zhì)譜測得的梯形序列里得到闡明。另外,Zhong等還提出了質(zhì)譜結(jié)合微波輔助酸水解的階梯式測序方法,通過25%的三氟乙酸溶解蛋白質(zhì),用普通微波輻射10min后,用質(zhì)譜直接檢測其酸水解的梯度產(chǎn)物進行蛋白質(zhì)序列的分析。2.2.2磺酸基修飾n端肽許多對末端肽的研究方法采用的是質(zhì)譜技術(shù)與多種化學方法及生物酶法的結(jié)合,通過N端的各種化學標記,運用MS/MS或多級質(zhì)譜(MSn)的碰撞誘導裂解(collisioninduceddissociation,CID)、源后裂解(post-sourcedecay,PSD)等碎裂技術(shù)測序,或標記的N端肽段先經(jīng)過選擇性的分離,再進行從頭測序。Noga等通過N端肽的乙酰化/氘代乙酰化的1:1修飾,運用快原子轟擊(fastatombombardment,FAB)質(zhì)譜進行標記N端肽的鑒定。Keough等首先發(fā)現(xiàn),通過在酶切肽段的N端引入帶一個單位負電荷的磺酸基,有利于肽段的從頭測序。這種酰化修飾可以促進肽鏈酰胺鍵在MALDI源質(zhì)譜中的斷裂并抑制N端碎片離子的生成,產(chǎn)生連續(xù)的y離子系列。本實驗室曾通過鄰磺基苯甲酸環(huán)酐對蛋白質(zhì)的N端肽進行磺酸化修飾,使其在一級負離子模式下成為便于識別的基峰,并通過MALDIMS的PSD二級質(zhì)譜分析,形成連續(xù)的y離子系列碎片,實現(xiàn)了對N端肽序列的測定。Yamaguchi等將蛋白質(zhì)經(jīng)過還原、烷基化和側(cè)鏈氨基的胍基化封閉,用不同的生物素類試劑標記自由的N端,標記后的蛋白質(zhì)經(jīng)胰蛋白酶酶切后,通過抗生物素親和體系將標記的N端肽分離出來,再通過MALDI-TOF/MALDI-TOF-PSDMS從頭測序,獲得了N端肽的序列。Gevaert等提出對角線色譜法(combinedfractionaldiagonalchromatography,COFRADIC)進行N端肽的研究,利用肽段在末端氨基的2,4,6-三硝基氟苯修飾前、后在反相色譜上的色譜行為的差異定位N端肽,從人血小板的細胞質(zhì)和膜骨骼蛋白質(zhì)組分中鑒定出305個N端肽,此法還應(yīng)用于嗜鹽菌的N端肽分析。N端肽的化學修飾除了便于其檢測,還被嘗試用于蛋白質(zhì)的相對定量研究。如通過合成磺苯基異硫氰酸(SPTIC)的穩(wěn)定同位素類試劑13C-SPITC,與常規(guī)的12C-SPITC試劑一起進行蛋白質(zhì)標記,不僅有利于肽段從頭測序,而且無論使用MALDI-TOF/TOF還是RPLC-ESI-MS/MS,對標準蛋白的相對定量都得到了理想的效果。Hsu等利用對N端肽的雙甲基化標記,大大提高了衍生肽段在二級質(zhì)譜中的a1離子信號。他們將這種在非衍生化肽段中很難被檢測到的a1離子作為N端氨基酸的質(zhì)量標簽,增加了肽段從頭測序和數(shù)據(jù)庫檢索的可靠性,并以血紅蛋白為例考查了用于蛋白質(zhì)相對定量的可行性。目前上述方法大多還處在在簡單體系中探索的階段,只有少數(shù)已應(yīng)用于蛋白質(zhì)組的N端分析,操作也很繁瑣;N末端天然封閉的蛋白質(zhì)測序的方法還需要進一步改進。2.2.3封閉n端肽的分離與maldi-tof-ms鑒定蛋白質(zhì)的N端常常發(fā)生甲基化、乙酰化、焦谷氨酸環(huán)化等各種修飾。各種修飾使得N端被封閉,無法進行直接的Edman降解測序,也無法結(jié)合化學修飾進行質(zhì)譜鑒定。且去除N端封閉基團的方法都不具普遍適用性。如何將這種封閉的N端肽從大量自由N端肽段中分離出來,降低肽段混合物的復雜程度,提高N端肽質(zhì)譜鑒定的機會,對蛋白質(zhì)末端信息的獲得和分析十分重要。Gorman等最早提出使用離子交換色譜,利用封閉N端肽與中間肽段的堿性不同,分離鑒定了病毒蛋白質(zhì)的N端肽。Dormeyer等報道了一種迭代數(shù)據(jù)庫搜索策略,對來自人胚胎癌細胞粗膜的肽段的強陽離子交換色譜(SCX)餾分進行末端肽的目標分析發(fā)現(xiàn),鑒定到的非冗余N乙酰化肽段中,超過80%在10min內(nèi)被低鹽流動相從SCX色譜柱上洗脫,表明SCX技術(shù)在一定程度上可用于蛋白質(zhì)N端肽的分離。最近,Coussot等使用金屬內(nèi)切蛋白酶Lys-N,利用異硫氰酸苯酯修飾的玻璃珠共價結(jié)合中間肽,實現(xiàn)了碳酸酐酶封閉N端肽的分離和MALDI-TOFMS鑒定,這種反應(yīng)有較好的特異性,但所用金屬內(nèi)切酶Lys-N的酶切作用過于溫和,一些位點可能不會被切開,不利于MALDIMS的檢測。Toshiyuki等最近也報道了用異氰酸基團來修飾樹脂,通過控制弱酸性反應(yīng)條件去除胰蛋白酶酶切后所有自由氨基端的肽段,很好地實現(xiàn)了封閉N端肽的分離及MALDIMS鑒定。這些新方法通過去除自由N端肽段,減少了體系的復雜程度,對N端肽的鑒定有著潛在的應(yīng)用價值。3蛋白質(zhì)n端測序技術(shù)的展望綜上所述,蛋白質(zhì)和多肽的N端序列分析,隨著經(jīng)典方法、基于質(zhì)譜的各種化學修飾以及酶法輔助技術(shù)不斷地發(fā)展和完善,獲得了豐富的末端肽序列信息,為蛋白質(zhì)的準確鑒定提供了有力的依據(jù),并加深了我們對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的理解。但目前現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫僅提供了少量甚