n端氨基酸序列測序研究進展

氨基酸序列的測定是了解蛋白質性質和功能的重要路徑。氮和氨基酸是重要的結構和功能部位。序列具有很高的特異性。我們可以通過在n端少數氨基酸殘基中測定某些氨基酸。例如,可以通過對蛋白質和多肽類藥物的N端進行人工修飾(如環化修飾、甲基化修飾等),提高其降解穩定性延長藥效。因此N端肽段的鑒定具有非常重要的意義,本文對近年來蛋白質和多肽N端測序技術及方法進行了綜述。1核心組蛋白的td-4/d定位與操作所有蛋白質合成都起始于N端,其序列組成對其生物學功能有著巨大的影響。(1)蛋白質的半衰期與N端氨基酸的特異性有關,或者說N端氨基酸殘基對蛋白質的壽命有控制作用;(2)N端序列與蛋白質的亞細胞器定位有密切關系,例如,某些特殊的氨基酸序列可以作為蛋白質分選標記影響蛋白質定位;(3)蛋白質的N端可發生許多種翻譯后修飾,影響其結構和功能。如在新生肽鏈的成熟過程中,2/3的葉綠體蛋白質會發生起始甲硫氨酸殘基的剪切和前導肽的去除;又如核心組蛋白N端賴氨酸的可逆乙?；揎検菇M蛋白與DNA間的作用減弱,導致染色體局部解旋,促進基因轉錄,而去乙?；瘎t抑制基因轉錄。這種乙?；腿ヒ阴；^程中的任何異常都會導致生長、發育的紊亂,誘發白血病、皮膚癌等疾病。因此,通過對蛋白質N端序列的研究有利于分析蛋白質的高級結構,揭示蛋白質的生物學功能。2蛋白質和茶多酚n端測量技術2.1edan降解1955年,FrederickSanger采用二硝基氟苯(FDNB)法,首次成功地完成了第一個蛋白質——牛胰島素的序列分析。在此測序方法的基礎上,瑞典有機化學家Edman提出了蛋白質N端順序測定方法——Edman降解。之后隨著基于此原理的液相、固相及氣相自動蛋白質序列分析儀的推出和逐步完善,經典的Edman降解法已經廣泛應用于蛋白質的N端測序。Chen等在微流控芯片上進行Edman反應,使得肽段測序的靈敏度提高到亞飛摩爾水平;并利用Edman反應2次循環得到肽段的串聯質譜(MS/MS)圖的b2離子為內標,獲得了更好的二級質量準確度,實現了肽段快速、可靠的測序。但Edman降解方法受到以下諸多限制:(1)用于序列分析的蛋白質或多肽必須是高純度的;(2)N端封閉的蛋白質難以進行Edman反應,雖然出現了一些去除N端封閉基團的方法,例如用蛋白酶去除N端焦谷氨酸和通過酸催化的親核取代去除N乙酰化絲氨酸和N乙酰化蘇氨酸殘基等,但都只適于一定殘基的特定修飾,沒有普遍適用性,且許多末端殘基修飾是無法移去的;(3)不適于高通量分析,靈敏度不夠。但是Edman降解對于整體純化的蛋白的N端序列分析仍是很有價值的研究工具。人們還利用RT-PCR從編碼蛋白質的mRNA得到其cDNA序列,再根據遺傳密碼表反推出其相應的氨基酸序列。20世紀80年代出現了從基因組中找出編碼蛋白質的基因,測定其DNA序列,再反推出蛋白質的氨基酸序列的技術。其特點是更加簡便、快速,但利用RT-PCR或測定基因組的堿基序列也不能完全描述蛋白質的一級結構,它對翻譯加工所導致的氨基酸殘基的修飾及突變等情況無能為力。2.2激光解吸放電-飛行時間技術的應用質譜(MS),尤其是電噴霧(electrasprayionization,ESI)和基質輔助激光解吸電離-飛行時間(matrix-assistedlaserddesorption/ionizationtime-of-fight,MALDI-TOF)的出現,使質譜技術在蛋白質結構分析中的應用發生了革命性的飛躍。高靈敏度、高準確性、高分辨率和高通量的生物質譜技術為蛋白質的N端測序提供了一種重要的選擇。2.2.1氨基酸序列的確定是間接肽序列測定技術,通過末端酶解或化學降解產生一組相互之間僅差一個氨基酸殘基的多肽系列,經MALDI-TOFMS鑒定后,根據所得到的肽階梯圖中各肽段的相對分子質量差值確定末端的氨基酸序列,從而用于數據庫查詢。階梯測序是最早探索用質譜進行蛋白質測序的例子,經過幾個Edman反應循環的肽段混合物被MALDIMS檢測,原始肽段的序列就可從質譜測得的梯形序列里得到闡明。另外,Zhong等還提出了質譜結合微波輔助酸水解的階梯式測序方法,通過25%的三氟乙酸溶解蛋白質,用普通微波輻射10min后,用質譜直接檢測其酸水解的梯度產物進行蛋白質序列的分析。2.2.2磺酸基修飾n端肽許多對末端肽的研究方法采用的是質譜技術與多種化學方法及生物酶法的結合,通過N端的各種化學標記,運用MS/MS或多級質譜(MSn)的碰撞誘導裂解(collisioninduceddissociation,CID)、源后裂解(post-sourcedecay,PSD)等碎裂技術測序,或標記的N端肽段先經過選擇性的分離,再進行從頭測序。Noga等通過N端肽的乙酰化/氘代乙?；?:1修飾,運用快原子轟擊(fastatombombardment,FAB)質譜進行標記N端肽的鑒定。Keough等首先發現,通過在酶切肽段的N端引入帶一個單位負電荷的磺酸基,有利于肽段的從頭測序。這種酰化修飾可以促進肽鏈酰胺鍵在MALDI源質譜中的斷裂并抑制N端碎片離子的生成,產生連續的y離子系列。本實驗室曾通過鄰磺基苯甲酸環酐對蛋白質的N端肽進行磺酸化修飾,使其在一級負離子模式下成為便于識別的基峰,并通過MALDIMS的PSD二級質譜分析,形成連續的y離子系列碎片,實現了對N端肽序列的測定。Yamaguchi等將蛋白質經過還原、烷基化和側鏈氨基的胍基化封閉,用不同的生物素類試劑標記自由的N端,標記后的蛋白質經胰蛋白酶酶切后,通過抗生物素親和體系將標記的N端肽分離出來,再通過MALDI-TOF/MALDI-TOF-PSDMS從頭測序,獲得了N端肽的序列。Gevaert等提出對角線色譜法(combinedfractionaldiagonalchromatography,COFRADIC)進行N端肽的研究,利用肽段在末端氨基的2,4,6-三硝基氟苯修飾前、后在反相色譜上的色譜行為的差異定位N端肽,從人血小板的細胞質和膜骨骼蛋白質組分中鑒定出305個N端肽,此法還應用于嗜鹽菌的N端肽分析。N端肽的化學修飾除了便于其檢測,還被嘗試用于蛋白質的相對定量研究。如通過合成磺苯基異硫氰酸(SPTIC)的穩定同位素類試劑13C-SPITC,與常規的12C-SPITC試劑一起進行蛋白質標記,不僅有利于肽段從頭測序,而且無論使用MALDI-TOF/TOF還是RPLC-ESI-MS/MS,對標準蛋白的相對定量都得到了理想的效果。Hsu等利用對N端肽的雙甲基化標記,大大提高了衍生肽段在二級質譜中的a1離子信號。他們將這種在非衍生化肽段中很難被檢測到的a1離子作為N端氨基酸的質量標簽,增加了肽段從頭測序和數據庫檢索的可靠性,并以血紅蛋白為例考查了用于蛋白質相對定量的可行性。目前上述方法大多還處在在簡單體系中探索的階段,只有少數已應用于蛋白質組的N端分析,操作也很繁瑣;N末端天然封閉的蛋白質測序的方法還需要進一步改進。2.2.3封閉n端肽的分離與maldi-tof-ms鑒定蛋白質的N端常常發生甲基化、乙?；⒔构劝彼岘h化等各種修飾。各種修飾使得N端被封閉,無法進行直接的Edman降解測序,也無法結合化學修飾進行質譜鑒定。且去除N端封閉基團的方法都不具普遍適用性。如何將這種封閉的N端肽從大量自由N端肽段中分離出來,降低肽段混合物的復雜程度,提高N端肽質譜鑒定的機會,對蛋白質末端信息的獲得和分析十分重要。Gorman等最早提出使用離子交換色譜,利用封閉N端肽與中間肽段的堿性不同,分離鑒定了病毒蛋白質的N端肽。Dormeyer等報道了一種迭代數據庫搜索策略,對來自人胚胎癌細胞粗膜的肽段的強陽離子交換色譜(SCX)餾分進行末端肽的目標分析發現,鑒定到的非冗余N乙?；亩沃?超過80%在10min內被低鹽流動相從SCX色譜柱上洗脫,表明SCX技術在一定程度上可用于蛋白質N端肽的分離。最近,Coussot等使用金屬內切蛋白酶Lys-N,利用異硫氰酸苯酯修飾的玻璃珠共價結合中間肽,實現了碳酸酐酶封閉N端肽的分離和MALDI-TOFMS鑒定,這種反應有較好的特異性,但所用金屬內切酶Lys-N的酶切作用過于溫和,一些位點可能不會被切開,不利于MALDIMS的檢測。Toshiyuki等最近也報道了用異氰酸基團來修飾樹脂,通過控制弱酸性反應條件去除胰蛋白酶酶切后所有自由氨基端的肽段,很好地實現了封閉N端肽的分離及MALDIMS鑒定。這些新方法通過去除自由N端肽段,減少了體系的復雜程度,對N端肽的鑒定有著潛在的應用價值。3蛋白質n端測序技術的展望綜上所述,蛋白質和多肽的N端序列分析,隨著經典方法、基于質譜的各種化學修飾以及酶法輔助技術不斷地發展和完善,獲得了豐富的末端肽序列信息,為蛋白質的準確鑒定提供了有力的依據,并加深了我們對蛋白質的結構和功能的理解。但目前現有的數據庫僅提供了少量甚