蛋白質分離純化的一般程序可分為以下幾個步驟：（一）材料的預處理及細胞破碎分離提純某一種蛋白質時，首先要把蛋白質從組織或細胞中釋放出來并保持原來的天然狀態，不喪失活性。所以要采用適當的方法將組織和細胞破碎。常用的破碎組織細胞的方法有：1.機械破碎法這種方法是利用機械力的剪切作用，使細胞破碎。常用設備有，高速組織搗碎機、勻漿器、研缽等。2.滲透破碎法這種方法是在低滲條件使細胞溶脹而破碎。3.反復凍融法生物組織經凍結后，細胞內液結冰膨脹而使細胞脹破。這種方法簡單方便，但要注意那些對溫度變化敏感的蛋白質不宜采用此法。4.超聲波法使用超聲波震蕩器使細胞膜上所受張力不均而使細胞破碎。5.酶法如用溶菌酶破壞微生物細胞等。（二） 蛋白質的抽提通常選擇適當的緩沖液溶劑把蛋白質提取出來。抽提所用緩沖液的pH、離子強度、組成成分等條件的選擇應根據欲制備的蛋白質的性質而定。如膜蛋白的抽提，抽提緩沖液中一般要加入表面活性劑（十二烷基磺酸鈉、tritonX-100等），使膜結構破壞，利于蛋白質與膜分離。在抽提過程中，應注意溫度，避免劇烈攪拌等，以防止蛋白質的變性。（三）蛋白質粗制品的獲得選用適當的方法將所要的蛋白質與其它雜蛋白分離開來。比較方便的有效方法是根據蛋白質溶解度的差異進行的分離。常用的有下列幾種方法：等電點沉淀法不同蛋白質的等電點不同，可用等電點沉淀法使它們相互分離。鹽析法不同蛋白質鹽析所需要的鹽飽和度不同，所以可通過調節鹽濃度將目的蛋白沉淀析出。被鹽析沉淀下來的蛋白質仍保持其天然性質，并能再度溶解而不變性。有機溶劑沉淀法中性有機溶劑如乙醇、丙酮，它們的介電常數比水低。能使大多數球狀蛋白質在水溶液中的溶解度降低，進而從溶液中沉淀出來，因此可用來沉淀蛋白質。此外，有機溶劑會破壞蛋白質表面的水化層，促使蛋白質分子變得不穩定而析出。由于有機溶劑會使蛋白質變性，使用該法時，要注意在低溫下操作，選擇合適的有機溶劑濃度。四）樣品的進一步分離純化用等電點沉淀法、鹽析法所得到的蛋白質一般含有其他蛋白質雜質，須進一步分離提純才能得到有一定純度的樣品。常用的純化方法有：凝膠過濾層析、離子交換纖維素層析、親和層析等等。有時還需要這幾種方法聯合使用才能得到較高純度的蛋白質樣品。卵清蛋白分離提取及純化的具體試驗步驟一、實驗目的與原理雞卵粘蛋白存在于雞蛋清中，對胰蛋白酶有強烈的抑制作用，高純度的雞卵粘蛋白抑制胰蛋白酶的分子酶的分子比為1:1。雞卵粘蛋白在中性或酸性溶液中對熱和高濃度的脲都是相當穩定的，而在堿性溶液中較不穩定。由于雞卵粘蛋白對胰蛋白酶有強烈的抑制作用，因此可以用雞卵粘蛋白做親和配基配制純化胰酶的親和材料。二、材料與試劑：1．材料：新鮮雞蛋2只2：儀器：抽濾瓶500—1000ml、燒結漏斗、移液器、磁力攪拌器3：試劑：10%TCA，用固體NaOH調調PH至1.05—1.10,需要50ml、5NHCL、5NNaOH、冷丙酮、胰蛋白酶液、BAEE—0?05M,PH8.0Tris—HCL緩沖液（每ml含0.34BAEE和2.22mgCaCL2），50mlpH8.0,0.1MTris-HCL緩沖液三、操作步驟取兩只新鮮雞蛋，得蛋清50ml，置于燒杯中，外用溫水浴25C—30C，在不斷攪拌條件下，緩慢加入等體積得三氯乙酸一丙酮（1：2V/V），立即出現大量白色絮狀沉淀，加完后最終PH約3.5,再繼續攪拌30min,然后在4C冰箱中放置過夜。次日用布氏漏斗抽濾，得黃綠色清液。邊攪拌邊加入4C預冷的丙酮200ml沉淀蛋白，在4C放置2h之后將上清液小心倒入瓶中回收，下部沉淀部分于4000rpm離心5min，收集沉淀。將沉淀溶于10ml無離子水中，對無離子水（50倍）透析4h,換水兩次，再對碳酸鈉緩沖液透析過夜，4000rpm離心10min,去除不溶物。抗菌蛋白分純的步驟準備試劑：異丙醇含0.3M鹽酸胍的95匯醇無水乙醇1%SDS操作步驟：取沉淀DNA后剩余的上清，用異丙醇沉淀蛋白質。每使用1mlTRIzol加1.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘，2?8C12000Xg離心10分鐘棄上清。用含0.3M鹽酸胍的95%L醇洗滌蛋白質沉淀。每使用1mlTRIzol加2ml洗滌液，室溫放置20分鐘，2?8C7500Xg離心5分鐘，棄上清，重復兩次。用2ml無水乙醇同樣方法再洗一次。真空抽干蛋白質沉淀5?10分鐘，用1%SD溶解蛋白質，反復吸打，50C溫浴使其完全溶解，不溶物2?8C10000Xg離心10分鐘除去。分離得到的蛋白質樣品可用于WesternBlot或-5至-20C保存備用。注意事項：蛋白質沉淀可保存在含0.3M鹽酸胍的95聽醇或無水乙醇中2?8°C—個月以上或-5至-20C—年以上。用0.1%SDS在2?8C透析三次，10000Xg離心10分鐘取上清即可用于WesternBlot。常見問題分析：得率低：樣品裂解或勻漿處理不徹底。最后得到的蛋白質沉淀未完全溶解。蛋白質降解：組織取出后沒有馬上處理或冷凍。電泳時條帶變形：蛋白質沉淀洗滌不充分。丫球蛋白分離，純化，鑒定的方法（包括原理，步驟，預期結果，注意事項）[原理]血清中蛋白質按電泳法一般可分為五類：清蛋白、a1-球蛋白、a2-球蛋白、B-球蛋白和丫-球蛋白，其中丫-球蛋白含量約占16%,100ml血清中約含1.2g左右。首先利用清蛋白和球蛋白在高濃度中性鹽溶液中（常用硫酸銨）溶解度的差異而進行沉淀分離，此為鹽析法。半飽和硫酸銨溶液可使球蛋白沉淀析出，清蛋白則仍溶解在溶液中，經離心分離，沉淀部分即為含有丫-球蛋白的粗制品。用鹽析法分離而得的蛋白質中含有大量的中性鹽，會妨礙蛋白質進一步純化，因此首先必須去除。常用的方法有透析法、凝膠層析法等。本實驗采用凝膠層析法，其目的是利用蛋白質與無機鹽類之間分子量的差異。當溶液通過SephadexG--25凝膠柱時，溶液中分子直徑大的蛋白質不能進入凝膠顆粒的網孔，而分子直徑小的無機鹽能進入凝膠顆粒的網孔之中．因此在洗脫過程中，小分子的鹽會被阻滯而后洗脫出來，從而可達到去鹽的目的。脫鹽后的蛋白質溶液尚含有各種球蛋白，利用它們等電點的不同可進行分離。a—球蛋白、B-球蛋白的PK6.0；丫一球蛋白的PI為7.2左右。因此在PH6.3的緩沖溶液中，各類球蛋白所帶電荷不同。經DEAE二乙基氨基乙基）纖維素陰離子交換層析柱進行層析時， 帶負電荷的a—球蛋白和B-球蛋白能與DEAE纖維素進行陰離子交換而被結合；帶正電荷的丫一球蛋白則不能與DEAE纖維素進行交換結合而直接從層析柱流出。因此隨洗脫液流出的只有丫-球蛋白，從而使丫-球蛋白粗制品被純化。其反應式如下：用上述方法分離得到丫-球蛋白是否純凈，單一？可將純化前后的丫-球蛋白進行電泳比較而鑒定之。[操作]⑴鹽析 中性鹽沉淀：取正常人血清2.0ml于小試管中，加0?9%氯化鈉溶液2.0ml，邊攪拌混勻邊緩慢滴加飽和硫酸銨溶液乙 4.0ml,混勻后于室溫中放置10min,3000r/min離心10min。小心傾去含有清蛋白的上清液，重復洗滌一次，于沉淀中加入0.0175mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.3）0.5 1.0ml使之溶解。此液即為粗提的丫一球蛋白溶液。（2）脫鹽 凝膠柱層析裝柱洗凈的層析柱保持垂直位置，關閉出口，柱內留下約2.0ml洗脫液。一次性將疑膠從塑料接口加入層析柱內，打開柱底部出口，調節流速0.3ml/min。凝腔隨柱內溶液慢慢流下而均勻沉降到層析柱底部，最后使凝膠床達20厘米高，床面上保持有洗脫液，操作過程中注意不能讓凝膠床表面露出液面并防止層析床內出現“紋路”。在凝膠表面可蓋一園形濾紙，以免加入液體時沖起膠粒。上樣與洗脫：可以在凝膠表面上加圓形尼龍濾布或濾紙使表面平整，小心控制凝膠柱下端活塞，使柱上的緩沖液面剛好下降至凝膠床表面，關緊下端出口，用長滴管吸取鹽析球蛋白溶液，小心緩慢加到凝膠床表面。打開下端出口，將流速控制在0.25ml/min使樣品進入凝膠床內。關閉出口，小心加入少量0.0175mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.3)洗柱內壁。打開下端出口，待緩沖液進入凝膠床后再加少量緩沖液。如此重復三次，以洗凈內壁上的樣品溶液。然后可加入適量緩沖液開始洗脫。加樣開始應立即收集洗脫液。洗脫時接通蠕動泵，流速為0.5ml/min,用部分收集器收集，每管1ml。洗脫液中NH4與蛋白質的檢查：取比色板兩個(其中一個為黑色背底)，按洗脫液的順序每管取一滴，分別滴入比色板中，前者加20%磺基水楊酸溶液2滴，出現白色混濁或沉淀即示有蛋白質析出，由此可估計蛋白質在洗脫各管中的分布及濃度；于另一比色板中，加人奈氏試劑應用液 l滴，以觀察NH4出現的情況。合并球蛋白含量高的各管，混勻。除留少量作電泳鑒定外，其余用 DEAE千維素陰離子交換柱進一步純化。純化 DEAE千維素陰離子交換層析：用DEAE纖維素裝柱約8T0cm高度，并用0.0175mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6?3)平衡，然后將脫鹽后的球蛋白溶液緩慢加于DEAE纖維素陰離子交換柱上，用同一緩沖液洗脫、分管收集。用 20%磺基水楊酸溶液檢查蛋白質分布情況。(裝柱、上樣、洗脫，收集及蛋白質檢查等操作步驟同凝膠層析)。濃縮一一經DEAE纖維素陰離于交換柱純化的丫—球蛋白液往往濃度較低。為便于鑒定，常需濃縮。收集較濃的純化的丫一球蛋白溶液2m1,按每ml加0.2?0.25gSephadexG一25干膠，搖動2?3min,3000r/min離心5min。上清液即為濃縮的丫-球蛋白溶液。鑒定――乙酸纖維素薄膜電泳取乙酸纖維素薄膜2條，分別將血清、脫鹽后的球蛋白、DEAE千維素陰離子交換柱純化的丫-球蛋白液等樣品點上。然后參閱實驗二十四：乙酸纖維薄膜電泳法進行電泳分離、染色。比較電泳結果。[注意事項](1)凝膠及DEAE纖維處理期間，必須小心用傾瀉法除去細小顆粒。這樣可使凝膠及千維素顆粒大小均勻，流速穩定，分離效果好。裝柱是層析操作中最重要的一步。為使柱床裝得均勻，務必做到凝膠懸液或DEAE千維素混懸液不稀不厚，一般濃度為I:l，進樣及洗脫時切勿使床面暴露在空氣中，不然柱床會出現氣泡或分層現象；加樣時必須均勻，切勿攪動床面，否則均會影響分離效果。本法是利用丫-球蛋白的等電點與a-、B-球蛋白不同，用離子交換層析法進行分離的。因此層析過程中用的緩沖液 pH要求精確。電泳注意事項見實驗二十四。凝膠貯存：凝膠使用后如短期不用，為防止凝膠發霉可加防腐劑如0.02%疊氮鈉。保存于4C冰箱內。若長期不用，應脫水干燥保存。脫水方法：將膨脹凝膠用水洗凈。用多孔漏斗抽干后，逐次更換由稀到濃的乙醇溶液浸泡若干時間，最后一次用95%乙醇溶液浸泡脫水，然后用多孔漏斗抽干后，于 6080C烘干貯存。離子交換劑的再生和保存；離子交換劑的價格較貴，每次用后只需再生處理便能反復使用多次。處理方法是：交替用酸、堿處理，最后用水洗至接近中性。陽離子交換劑最后為Na型，陰離子以Cl型是最穩定型，故陰離子交換劑處理順序為堿一水一酸一水。由于上述交換劑都是糖鏈結構。容易水解破壞，因此須避免強酸、強堿長時間浸泡和高溫處理，一般千維素浸泡時間為3-4h。離子交換劑容易長霉引起變質，不用時，需洗滌干凈，加防腐劑置冰箱內保存。常用0.02%疊氮鈉防腐。疊氮鈉遇酸放出有毒氣體，也是劇毒與易爆的危險品。使用時要加倍小心。除用凝膠層析法去除無機鹽類外，最常用的去鹽法就是透析。細的透析袋效率高，所需時間短。將透析袋一端折疊，用橡皮筋結扎，試驗是否逸漏，然后倒入待透析的蛋白質溶液。勿裝太滿，將袋的上端也結扎好，即可進行透析。開始可用流動的自來水，待大部分鹽被透析出后，再改為生理鹽水、緩沖液或蒸餾水。透析最好在較低的溫度下，并在磁力攪拌器上進行。此法簡單，易操作，儀器及試劑要求不高，但不如凝膠層析法效率高濃縮丫-球蛋白粗提液除上述方法外還可用透析袋濃縮。將待濃縮的蛋白質溶液放入較細的透析袋中，置入搪瓷盤內。透析袋周圍可撒上聚乙二醇6000(PEG6000),或聚乙烯吡咯酮，或蔗糖。以上物質在使用后 (吸了大量水)都可以通過加溫及吹風而回收；將裝有蛋白質溶液的透析袋懸掛起來，用電風扇高速吹風(10C以下)，也可達到濃縮目的，以上兩法雖不如SephadexG—25干膠快，但價格較便宜，方法也不煩瑣。[試劑]飽和硫酸銨溶液：稱固體硫酸銨(分析純)850g,置于1000ml蒸餾水中，在70—80C水溫中攪拌溶解。將酸度調節至pH7.2,室溫中放置過夜，瓶底析出白色結晶，上清液即為飽和硫酸銨溶液。葡聚糖凝膠G一25的處理：按每100ml凝膠床體積需要葡聚糖凝膠G一25干膠25g。稱取所需量置于錐形瓶中。每克干膠加入蒸餾水約 30ml，用玻璃棒輕輕混勻，置于90?100C水溫中時時攪動，使氣泡逸出。1h后取出，稍靜置，傾去上清液細粒。也可于室溫中浸泡24h，攪拌后稍靜置，傾去上清液細粒，用蒸餾水洗滌2?3次，然后加0.017mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.3)平衡，備用。⑶DEAE—32(二乙基氨基乙基一32)纖維素的處理：按100ml柱床體積需DEAE千維素14g稱取，每克加0?5mol/L鹽酸溶液15ml，攪拌。放置30min(鹽酸處理時間不可太長，否則DEAE纖維素變質)。加約10倍量的蒸餾水攪拌，放置片刻，待纖維素下沉后，傾棄含細微懸浮物的上層液。如此反復數次。靜置30min,虹吸去除上清液(也可用布氏漏斗抽干)，直至上清液pH>4為止。加等體積lmol/L氫氧化鈉溶液，使最終濃度約為0.5mol/L氫氧化鈉，攪拌后放置30min,以虹吸除去上層液體。同上用蒸餾水反復洗至pH<7為止。虹吸去除上層液體，然后加入0.0175mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.3)平衡，備用。0.0175mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.3)A液：稱取磷酸二氫鈉(NaH2P04?2H20)2?730g溶于蒸餾水中，加蒸餾水稀釋至1000ml。B液：稱取磷酸氫二鈉(Na2HP04?12H20)6?269g，溶于蒸