藤梨根對人結腸癌rko細胞懸浮生長及失巢凋亡的影響

抗癲癇藥物的使用已經成為中醫臨床上的一種重要治療方法，對研究闡明了抗癲癇藥物的作用和特點具有重要意義。藤梨根是中醫腫瘤臨床常用中藥,其主要成分包括多糖、熊果酸、齊墩果酸等,藤梨根具有抗氧化、抗癌以及抗血管生成等藥理作用;已證實藤梨根在大腸癌、胃癌、肺癌等多種腫瘤中具有抗癌作用,但藤梨根對懸浮腫瘤細胞的作用缺乏研究。本研究在大腸癌細胞模型中觀察了藤梨根對懸浮生長大腸癌細胞的作用,以期為臨床用藥及進一步研究提供基礎。1材料表面1.1藥物、藥物等的混溶藥藤梨根由龍華醫院中藥房提供,批號2012040506,產地江蘇,上海華浦中藥飲片有限公司;藤梨根由龍華醫院藥劑科許麗雯副主任藥師鑒定,為獼猴桃科植物中華獼猴桃ActinidiachinensisPlanch的干燥根。1.2y和polush-hema人結腸癌細胞株RKO(購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫),CytoSelectTM24-WellAnoikisAssay(批號11665,美國CellBiolabs公司),CellCountingKit-8(CCK-8,批號DL765,[東仁化學科技(上海)有限公司],poly-HEMA(批號SLBB4988V,美國SigmaAldrich公司);Caspase-3活性檢測試劑盒(批號313323,美國Promega公司),活性氧檢測試劑盒(批號0402261212,江蘇碧云天生物技術研究所)。1.3酶標儀和檢測方法NAPCO-5410型二氧化碳培養箱(美國Napco公司),ThermoVarioskan型酶標儀(美國Thermo公司),Olympus1×70型倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。2細胞存活率及caspase-3活性檢測2.1中藥制備參考文獻方法制備中藥,藤梨根300g加8倍量水,浸泡1h,煎煮2次,每次30min,紗布粗濾去渣,合并濾液、濃縮,18000r·min-1離心30min,取上清加入等體積乙醇,4℃過夜;18000r·min-1離心30min,取上清液冰凍干燥,稱重,無血清RPMI1640溶解,調濃度至400g·L-1,依次0.45,0.22μm濾器過濾除菌,1mL分裝,4℃保存備用。2.2細胞懸浮生長檢測1×104個對數生長期RKO細胞接種于poly-HEMA包被96孔板,根據預實驗結果接種后第2天加入終質量濃度200～800mg·L-1藤梨根或等體積RPMI1640,每組3個復孔;藥物作用24h后加入10μLCCK-8,37℃反應2h,酶標儀450nm波長檢測各孔吸光度(A),計算細胞存活率。細胞存活率=A實驗組/A對照組×100%2.3失巢凋亡檢測1×105個對數生長期RKO細胞接種于poly-HEMA包被24孔板,接種后第2天加入不同質量濃度中藥或等體積RPMI1640,每組3個復孔;藥物作用24h后加入1μLEthD-1,37℃反應1h,熒光酶標儀檢測A(激發波長525nm,發射波長590nm),熒光顯微鏡下觀察細胞形態。2.4caspase-3活性檢測1×106個對數生長期RKO細胞接種于poly-HEMA包被直徑6cm培養皿,接種后第2天加入不同質量濃度中藥或等體積RPMI1640,每組3個樣本;藥物作用24h后收集細胞,按操作說明書采用酶底物法檢測caspase-3活性。2.5活性氧檢測5×105對數生長期RKO細胞接種細胞于poly-HEMA包被6孔板,接種后第2天加入不同濃度中藥或等體積RPMI1640,空白組不作處理,每組3個樣本;藥物作用24h后收獲細胞,加入含DCFH-DA探針(10μmol·L-1)的無血清RPMI1640,37℃孵育20min后,酶標儀測各孔A(激發波長488nm,發射波長525nm)。2.6統計學分析采用SPSS16.0統計軟件進行統計分析,計量資料以xˉ±sxˉ±s表示,組間比較采用單向方差分析,組間兩兩比較用LSD法,以P<0.05為差異有統計學意義。3結果3.1rk細胞的懸浮生長影響200～800mg·L-1藤梨根可顯著抑制RKO細胞懸浮生長,與對照組比較差異顯著(P<0.01)。見圖1。3.2藤梨根對rko細胞凋亡的影響200～800mg·L-1藤梨根作用后RKO細胞可吸收EthD-1呈現紅色熒光,部分細胞可見核碎裂,藤梨根不同劑量組熒光吸光度(A)與對照組比較差異顯著(P<0.01),提示藤梨根可促RKO細胞失巢凋亡。見圖2。3.3rk細胞cappare-3的活性200～800mg·L-1藤梨根可以顯著增強懸浮生長RKO細胞caspase-3活性(P<0.01)。見圖3。3.4藤梨根對ros活性的影響200～800mg·L-1藤梨根可以顯著升高懸浮生長RKO細胞內ROS水平,藤梨根不同劑量組熒光A與對照組比較差異顯著(P<0.01)。見圖4。4藤梨根對rko細胞凋亡和caspase-3活性的影響上皮細胞需要胞外基質上提供存活信號,脫離胞外基質黏附細胞將發生凋亡,即失巢凋亡(anoikis),anoikis是1個希臘詞匯,原意無家可歸(homelessness);失巢凋亡現象由Frish等于1994年首次發現。上皮來源腫瘤細胞在血液或淋巴循環中的存活與失巢凋亡耐受相關。腫瘤細胞由于基因表達或活性異常而獲得一定程度的失巢凋亡耐受,使得部分腫瘤細胞可以在血液或淋巴循環中存活,最終導致腫瘤轉移,失巢凋亡已成為腫瘤治療新的靶標。poly-HEMA是一種無毒陰離子聚合物,具有均勻的非離子特性,鋪在培養皿底部,可阻止細胞貼壁,使細胞只能懸浮生長,本研究結果顯示藤梨根可以抑制結腸癌細胞在poly-HEMA包被板中的生長,提示藤梨根對懸浮生長結腸癌細胞具有抗癌作用。EthD-1(Ethidiumhomodimer)是一種核酸熒光染料,EthD-1可以進入破損細胞結合核酸,呈現紅色熒光信號,但不能滲透活細胞,因此常用作死亡細胞的熒光染色指示劑;CytoSelectTM24-WellAnoikisAssay試劑盒以EthD-1為標記,結合細胞在poly-HEMA包被板懸浮生長檢測細胞失巢凋亡。本研究EthD-1染色顯示藤梨根作用后部分RKO細胞吸收EthD-1呈現紅色熒光,部分細胞還可見核碎裂,提示藤梨根可以促使RKO細胞失巢凋亡。失巢凋亡是一種特殊形式的凋亡,失巢凋亡也是由caspase級聯反應介導的。上皮細胞與胞外基質黏附后經整合素介導,形成Focaladhesionplaque,促使黏著斑激酶(FAK)構象變化而活化。FAK下游信號轉導與MAPK,PI3K-AKT等信號通路有關。細胞脫離基質黏附后FAK到MAPK信號轉導受到抑制,致使細胞凋亡分子調控失常,活化caspases。與細胞凋亡一樣,失巢凋亡也可以通過內源或外源通路,分別活化caspase-9或caspase-8,進而激活細胞凋亡執行蛋白酶caspase-3,引發失巢凋亡。本研究發現藤梨根可以活化懸浮狀態RKO細胞caspase-3,提示藤梨根對RKO細胞失巢凋亡作用與caspase-3活性相關。ROS是細胞在有氧代謝過程中產生一系列活性氧簇,細胞內ROS水平變化可以引起腫瘤細胞一系列與細胞增殖、凋亡相關信號通路的變化,提高細胞內ROS水平可活化細胞內caspases活性,誘導腫瘤細胞凋亡。ROS是中藥活化caspase信號通路,介導抗癌作用的重要機制,已發現大黃素、姜黃素等中藥組分可以通過提高細胞內ROS水平促