老琥草中鞣質和總黃酮類物質的提取

秋天草是牛蒡科植物。它是一種古老的鸛草科野生動物。干燥的土壤是多年生草本植物。它嘗起來又重又苦，性格平。它進入肝、脾和腎。具有驅風、除濕、經絡、緩解和腹瀉的功效。常用于民間和實驗研究。研究結果表明,鞣質具有多種生物活性,如抗腫瘤、抗過敏、抗衰老等,黃酮類化合物具有降脂、抗血栓、抗氧化、降糖等多種生理活性。老鸛草的主要化學成分包括鞣質、黃酮、有機酸、揮發油等,且以鞣質和黃酮尤為豐富。因此,老鸛草中鞣質與黃酮具有很大的研究及開發價值。為了獲得經濟實用的老鸛草中鞣質和黃酮類物質提取方法,筆者等以乙醇作為提取溶劑,分別運用滲漉法與超聲提取法提取老鸛草中鞣質和總黃酮類化合物,用干酪素法測定鞣質含量,用比色法測定總黃酮含量,并對兩種提取方法進行了比較。1材料和方法1.1材料表面1.1.1特芬材料購自蘭州黃河中藥材市場,經蘭州大學藥學院鑒定為老鸛草,用粉碎機打成粗粉備用。1.1.2槲皮素對照品沒食子酸對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號110831-200302);槲皮素對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號100081-200406);Folin試劑:鎢酸鈉10g,加85%磷酸8mL,與蒸餾水75mL混合,加熱回流3h,冷卻后加水稀釋至100mL,避光保存。其余試劑均為分析純。1.1.3auw200e,koios公司,kueo分光光度計(Evolution60,Thermo公司),離心機(RC5Cplus,SORVALL公司),超聲儀(SK5200LH,KUOOS公司),電子天平(AUW120D,SHIMADZU公司)。1.2實驗方法1.2.1老氏草醇浸膏超聲提取液與老鰲草醇浸膏的復合方法,及其比較超聲提取液中新型助劑的含量測定以沒食子酸為對照品,利用鞣質在堿性條件下與鎢酸鈉反應產生藍色,其顏色深度與含量成正比的原理,測定老鸛草乙醇浸膏及超聲提取液中鞣質含量;以槲皮素為對照品,利用黃酮類分子中的酚羥基可與Al3+在堿性溶液中顯色的原理,測定老鸛草乙醇浸膏及超聲提取液中總黃酮含量。1.2.2對照品溶液的制備精密稱取干燥至恒重的沒食子酸對照品20mg,置于100mL棕色容量瓶中,加90%乙醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為對照品溶液Ⅰ。精密稱取干燥至恒重的槲皮素對照品6.7mg,置于25mL棕色容量瓶中,用90%乙醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為對照品溶液Ⅱ。1.2.3老連帶樹葉片浸膏的制備準確稱取老鸛草粗粉2g,加90%乙醇約30mL,超聲提取30min,提取后過濾,重復處理3次,用90%乙醇洗滌殘渣,合并提取液至100mL棕色容量瓶中,加90%乙醇至刻度,搖勻,作為供試品溶液Ⅰ(生藥濃度20mg/mL)。準確稱取老鸛草粗粉2.0kg,用93%的工業酒精浸潤后裝入滲漉柱,加入該濃度酒精并使液面浸沒藥粉,于室溫下密閉放置24h后,調節滲漉液呈勻速滴狀流出。共加入10倍量酒精,過濾、合并濾液,在55℃下將滲漉液減壓濃縮,揮干溶劑后得棕色浸膏(1g浸膏相當于25g生藥材),浸膏置于4℃冰箱貯存。精密稱取老鸛草浸膏100mg,用90%乙醇溶解并定容至50mL容量瓶中,搖勻,作為供試品溶液Ⅱ(生藥濃度50mg/mL)。1.2.4folin試劑分別量取對照品溶液Ⅰ1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于10mL棕色容量瓶中,分別依次加入90%乙醇溶液4.0、3.0、2.0、1.0、0mL于各容量瓶中,然后加入0.1mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(pH5.0)至刻度,搖勻。分別量取各溶液1.0mL置于另一組10mL棕色容量瓶中,各加入Folin試劑0.5mL,再加1.5%碳酸鈉溶液至刻度,搖勻,室溫放置15min后離心5min(3000r/min)。以不加沒食子酸的試劑混合液作為空白對照。將對照品溶液在500-900nm波長范圍內進行光譜掃描,確定最大吸收波長,根據在最大吸收波長處的吸光度,繪制標準曲線,得出回歸方程。精密量取對照品溶液Ⅱ0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL分別置于10mL棕色容量瓶中,加5%亞硝酸鈉0.3mL,放置6min,加10%硝酸鋁0.3mL,放置6min,加4%氫氧化鈉2mL,加90%乙醇至刻度,搖勻,放置15min。以不加槲皮素標準品的試劑混合液作為空白對照。將對照品溶液在250-700nm波長范圍內進行光譜掃描,確定最大吸收波長,根據在最大吸收波長處的吸光度,繪制標準曲線,得出回歸方程。1.2.5精密度測試精密量取同一對照品溶液6份,在最大吸收波長處測定吸光度,計算RSD值。1.2.6穩定性試驗待供試品溶液顯色后,分別對供試品溶液Ⅰ、Ⅱ每隔30min在最大波長處測定一次吸光度,連續考察3h,分析樣品含量差異。1.2.7樣品含量的測量1.2.7.不同碳酸鈉溶液的配制精密量取供試品溶液Ⅰ15mL、Ⅱ10mL分別盛于25mL棕色容量瓶中,各加入0.1mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖溶液10mL,再用90%乙醇定容至25mL、混勻,得樣品溶液Ⅰ、Ⅱ;分別精密量取1mL,置10mL棕色容量瓶中,加入Folin試劑0.5mL,再加1.5%碳酸鈉溶液至刻度,搖勻,室溫放置15min,后離心5min(3000r/min)。在780nm波長處測定吸光度,按標準曲線計算出供試品溶液中沒食子酸含量(mg)。1.2.7.供試品溶液中沒食子酸含量mg的測定分別精密量取供試品溶液Ⅰ、Ⅱ各10mL,加至已盛有干酪素0.35g的50mL具塞錐形瓶中,密塞,置30℃搖床,100r/min振搖1h后,取出,放冷,搖勻,過濾,棄去初濾液,精密量取續濾液1mL,置10mL棕色容量瓶中,加入Folin試劑0.5mL,再加1.5%碳酸鈉溶液至刻度,搖勻,室溫放置15min,后離心5min(3000r/min)。在780nm波長處測定吸光度,按標準曲線回歸方程計算出供試品溶液中沒食子酸含量(mg)。按下式計算鞣質的含量:鞣質含量=總酚量-不被吸附的多酚量1.2.7.硝酸鹽鋁溶液的配制分別精密量取供試品溶液Ⅰ5mL、Ⅱ3mL,置10mL棕色容量瓶中,加5%亞硝酸鈉0.3mL,放置6min,再加10%硝酸鋁0.3mL,放置6min,加4%氫氧化鈉2mL,加90%乙醇至刻度,搖勻,放置15min。在372nm波長處測定吸光度,按標準曲線回歸方程計算出供試品溶液中總黃酮含量(mg)。2結果2.1根據老鸛草中鉻含量的測定2.1.1標準曲線及線性范圍將對照品溶液在500-900nm波長范圍內進行光譜掃描,在780nm處均有最大吸收,故確定在780nm下測定各溶液的吸光度,在此波長處測定吸光度A為縱坐標,濃度C(mg/mL)為橫坐標,得回歸方程:A=123.665C+0.05427,r=0.99933,在0.002-0.010mg/mL的范圍內,沒食子酸濃度與吸光度有良好的線性關系。根據樣品在780nm的光吸收值按標準曲線回歸方程計算出供試品溶液中鞣質含量(mg),結果詳見表1。2.1.2精密度測試在波長780nm處測定吸光度,RSD為1.2591%(n=6),結果表明儀器精密度良好。2.1.3顯色后時間的確定待供試品溶液顯色后,分別對供試品溶液Ⅰ、Ⅱ每隔30min在波長780nm處測定一次吸光度,連續考察3h,結果表明顯色后15min至3h內樣品含量無顯著差異。表明供試品溶液在3h內穩定。2.2黃酮含量測定2.2.1線性關系將對照品溶液在250-700nm波長范圍內進行光譜掃描,在372nm處均有最大吸收。以372nm處測吸光度A為縱坐標,濃度C(mg/mL)為橫坐標,得回歸方程A=47.485C+0.00629,r=0.9991,在0.00268-0.0134mg/mL范圍內,槲皮素濃度與吸光度有良好的線性關系。根據樣品在372nm的光吸收值,按標準曲線回歸方程計算出供試品溶液中總黃酮含量(mg),結果詳見表2。2.2.2精密度測試精密量取同一對照品溶液6份,在波長372nm處測定吸光度,RSD為2.6433%(n=6),結果表明儀器精密度良好。2.2.3顯色后時間的確定待供試品溶液顯色后,分別對兩類供試品溶液每隔30min在波長372nm處測定一次吸光度,連續考察3h,結果表明顯色后15min至3h內樣品含量無顯著差異。表明供試品溶液在3h內穩定。3討論3.1生理活性的0.2法本實驗采用羅文毓等設計的改良干酪素法測定鞣質含量,其特點在于干酪素能選擇性地結合有生理活性的鞣質,因此測出的是具有生理活性的鞣質,而無生理活性的鞣