202091019101分析方法驗證〔analyticalmethodvalidation〕的目的是證明建立的方法適合于相應檢測要求。在建立藥品質量標準、變更藥品生產工藝和制劑組分、修訂原分析方法時，需對分析方法進展驗證。生物制品質量掌握中承受的方法包括理化分析方法和生物學測定方法，其中理化分析方法的驗證原則與化學藥品根本一樣，所以可參照本指導原則進展，但在進展具體驗證時還需要結合生物制品的特點考慮；相對于理化分析方法而言，生物學測定方法存在更多的影響因素，因此本指導原則不涉及生物學測定方法驗證的內容。驗證的分析工程：鑒別試驗、雜質檢查〔限度或定量分析〕、含量測定〔包括特性參數和含量/效價測定，其中特性參數如：藥物溶出度、釋放度等〕。驗證的指標有：專屬性、準確度、周密度〔包括重復性、中間精密度和重現性〕、檢測限、定量限、線性、范圍、耐用性。在分析方法中，須用標準物質進展試驗。由于分析方法具有各自的特點中，并隨分析對象而變化，因此需要視具體狀況擬訂驗證的指標。表1列出的分析工程和相應的驗證指標可供參考。1工程內容鑒別雜質測定含量測定-特性參數-含量或效價測定定量限度專屬性②++++準確度-+-+周密度重復性-+-+中間周密度-+①-+①檢測限〔LOD〕--③+-定量限(LOQ)-+--線性-+-+范圍-+-+耐用性++++1已有重現性驗證，不需要驗證中間周密度；23視具體狀況予以驗證。方法學驗證內容如下：一、專屬性專屬性系指在其他成分〔如雜質、降解產物、輔料等〕可能存在下，承受的分析方法能正確測定出被測物的力量。鑒別反響、雜質檢査和含量測定方法，均應考察其專屬性。如方法專屬性不強，應承受一種或多種不同原理的方法予以補充。鑒別反響應能區分可能共存的物質或構造相像的化合物。不含被測成分的供試品，以及構造相像或組分中的有關化合物，應均呈陰性反響。含量測定和雜質測定承受的色譜法和其他分別方法，應附代表性圖譜，以說明方法的專屬性，并應標明諸成分在圖中的位置，色譜法中的分別度應符合要求。在雜質比照品可獲得的狀況下，對于含量測定，試樣中可參加雜質或輔料，考察測定結果是否受干擾，并可與未加雜質或輔料的試樣比較測定結果。對于雜質檢查，也可向試樣中參加肯定量的雜質，考察雜質之間能否得到分別。在雜質或降解產物不能獲得的狀況下，可將含有雜質或降解產物的試樣進展測定，與另一個閱歷證的方法或藥典方法比較結果。也可用強光照耀、高溫、高濕、酸〔堿〕水解或氧化的方法進展強制破壞，以爭論可能的降解產物和降解途徑對含量測定和雜質測定的影響。含量測定方法應比對兩種方法的結果，雜質檢査應比對檢出的雜質個數，必要時可承受光電二極管陣列檢測和質譜檢測，進展峰純度檢查。二、準確度準確度系指用所建立方法測定的結果與真實值或參比值接近的程度，一般用回收率〔%〕表示。準確度應在規定的線性范圍內試驗。準確度也可由所測定的周密度、專屬性推算出來。在規定范圍內，取同一濃度〔相當于 100%濃度水平〕的供試品，用至少6份樣品的測定結果進展評價；或設計至少3種不同濃度，每種濃度分別制備至少3份供試品溶液進展測定，用至少9份樣品的測定結果進展評價，且濃度的設定應考慮樣品的濃度范圍。兩種方法的選定應考慮分析的目的和樣品的濃度范圍。化學藥含量測定方法的準確度原料藥可用純度的比照品或供試品進展測定，或用所測定結果與準確度的另一個方法測定的結果進展比較。制劑可在處方量空白輔料中，參加量被測物比照品進展測定。如不能得到制劑輔料的全部組分，可向待測制劑中參加量的被測物進展測定，或用所建立方法的測定結果與準確度的另一個方法測定結果進展比較。化學藥雜質定量測定的準確度可向原料藥或制劑中參加量雜質比照品進展測定。如不能得到雜質比照品，可用所建立的方法與另一成熟的方法〔如藥典標準方法或經過驗證的方法〕的測定結果進展比較。中藥化學成分測定方法的準確度可用純度的比照品進展加樣回收率測定，即向被測成分含量的供試品中再周密參加肯定量的純度的被測成分比照品，依法測定。用實測值與供試品中含有量之差，除以參加比照品量計算回收率。在加樣回收試驗中須留意比照品的參加量與供試品中被測成分含有量之和必需在標準曲線線性范圍之內；參加的比照品的量要適當，過小則引起較大的相對誤差，過大則干擾成分相對削減，真實性差。數據要求對于化學藥應報告參加量的回收率〔%〕，或測定結果平均值與真實值之差及其相對標準偏差或置信區間〔置信度一般為95%〕于中藥應報告供試品取樣量、供試品中含有量、比照品參加量、測定結果和回收率〔%〕計算值，以及回收率〔%〕的相對標準偏差〔RSD%〕或置信區間。樣品中待測定成分含量和回收率限度關系可參考表2。在基質簡單、組分含量低于0.01%及多成分等分析中，回收率限度可適當放寬。表2樣品中待測定成分含量和回收率限度待測定成分含量待測定成分質量分數回收率限度〔%〕〔%〕〔ppm或ppb〕〔mg/g或μg/g〕〔g/g〕100–1000mg/g1.098～10110100000ppm100mg/g0.195～102110000ppm10mg/g0.0192～1050.11000ppm1mg/g0.00190～1080.01100ppm100μg/g0.000185～1100.00110ppm10μg/g0.0000180～1150.00011ppm1μg/g0.00000175～12010ppb0.01μg/g0.0000000170～125 *此表源自 AOAC《Guidelines for Single Laboratory Validationof ChemicalMethodsforDietarySupplementsandBotanicals》。三、周密度周密度系指在規定的測定條件下，同一份均勻供試品，經屢次取樣測定所得結果之間的接近程度。周密度一般用偏差、標準偏差或相對標準偏差表示。在一樣條件下，由同一個分析人員測定所得結果的周密度稱為重復性；在同一個試驗室內的條件轉變、不同分析人員、不同設備測等測定結果之間的周密度，稱為中間周密度；在不同試驗室測定結果之間的周密度，稱為重現性。含量測定和雜質的定量測定應考察方法的周密度。1.重復性在規定范圍內，取同一濃度〔分析方法擬定的樣品測定濃度，相當于100%濃度水平〕的供試品，用至少6份的測定結果進展評價；或3備至少3份供試品溶液進展測定，用至少9份樣品的測定結果進行評價。承受至少9份測定結果進展評價時，濃度的設定應考慮樣品的濃度范圍。2.中間周密度考察隨機變動因素如不同日期、不同分析人員、不同儀器對周密度的影響，應進展中間周密度試驗。3.重現性國家藥品質量標準承受的分析方法，應進展重現性試驗，如通過不同試驗室協同檢驗獲得重現性結果。協同檢驗的目的、過程和重現性結果均應記載在起草說明中。應注意重現性試驗所用樣品質量的全都性及貯存運輸中的環境對該全都性的影響，以免影響重現性試驗結果。4.數據要求均應報告標準偏差、相對標準偏差或置信區間。樣品中待測定成分含量和周密度RSD可承受范圍參考表3〔可承受范圍可在給出數值0.5～2倍區間，計算公式，重復性：RSDr=C-0.15；重現性：RSDR=2C-0.15，其中C〕。在基質簡單、組分含量低于0.01%及多成分等分析中，周密度限度可適當放寬。3待測定成分含量待測定成分質量分數重復性〔RSDr%〕重現性〔RSDR%〕〔%〕〔ppm或ppb〕〔mg/gμg/g〕〔g/g〕100–1000mg/g 1.012 10100000ppm100mg/g0.1 1.53110000ppm10mg/g0.0124 0.11000ppm1mg/g0.001360.01100ppm100μg/g0.0001480.00110ppm10μg/g0.000016110.00011ppm1μg/g0.00000181610ppb0.01μg/g0.000000011532 * 此 表 源 自 AOAC《Guidelines for Single Laboratory Validationof ChemicalMethodsforDietarySupplementsandBotanicals》。四、檢測限檢測限系指試樣中被測物能被檢測出的最低量。檢測限僅作為限度試驗指標和定性鑒別的依據，沒有定量意義。常用的方法如下。1.直觀法用濃度的被測物，試驗出能被牢靠地檢測出的最低濃度或量。2.信噪比法用于能顯示基線噪聲的分析方法，即把低濃度試樣測出的信號與空白樣品測出的信號進展比較，計算出能被牢靠地檢測出的被測3:1或時相應濃度或注入儀器的量確定檢測限。3.基于響應值標準偏差和標準曲線斜率法依據LOD=3.3δ/S公式計算。式中LOD：檢測限；δ：響應值的偏差；S：標準曲線的斜率。δ可以通過以下方法測得：〔1〕測定空白值的標準偏差；〔2〕標準曲線的剩余標準偏差或是截距的標準偏差。4.數據要求上述計算方法獲得的檢測限數據須用含量相近的樣品進展驗證。應附測定圖譜，說明試驗過程和檢測限結果。五、定量限定量限系指試樣中被測物能被定量測定的最低量，其測定結果應符合準確度和周密度要求。對微量或痕量藥物分析、定量測定藥物雜質和降解產物時，應確定方法的定量限。常用的方法如下。直觀法用濃度的被測物，試驗出能被牢靠地定量測定的最低濃度或量。信噪比法用于能顯示基線噪聲的分析方法，即低濃度試樣測出的信號與空白樣品測出的信號進展比較，計算出能被牢靠地定量的被測物質的最低濃度或量。一般以信噪比為10:1時相應濃度或注入儀器的量確定定量限。基于響應值標準偏差和標準曲線斜率法依據LOQ=10δ/S公式計算。式中LOQ：定量限；δ：響應值的偏差；S：標準曲線的斜率。δ可以通過以下方法測得：〔1〕測定空白值的標準偏差；〔2〕承受標準曲線的剩余標準偏差或是截距的標準偏差。數據要求上述計算方法獲得的定量限數據須用含量相近的樣品進展驗證。應附測試圖譜，說明測試過程和定量限結果，包括準確度和周密度驗證數據。六、線性線性系指在設計的范圍內，線性試驗結果與試樣中被測物濃度直接呈比例關系的力量。應在設計的范圍內測定線性關系。可用同一比照品貯備液經周密稀釋，或分別周密稱取比照品，制備一系列比照品溶液的方法進展測定，至少制備5種不同濃度水平。以測得的響應信號作為被測物濃度的函數作圖，觀看是否呈線性，再用最小二乘法進展線性回歸。必要時，響應信號可經數學轉換，再進展線性回歸計算。或者可承受描述濃度-響應關系的非線性模型。數據要求：應列出回歸方程、相關系數、殘差平方和、線性圖〔或其它數學模型〕。七、范圍范圍系指分析方法能到達周密度、準確度和線性要求時的凹凸限濃度或量的區間。范圍應依據分析方法的具體應用及其線性、準確度、周密度結果和要求確定。原料藥和制劑含量測定，范圍一般為測定濃度的 80%～120%；制劑含量均勻度檢査，范圍一般為測定濃度的70%～130%,特別劑型，如氣霧劑和噴霧劑，范圍可適當放寬；溶出度或釋放度中的溶出量測定，范圍一般為限度的±30%，如規定了限度范圍，則應為下限的－ 20%至上限的＋20%；雜質測定，范圍應依據初步實際測定數據，擬訂為規定限度的±20%。假設一個試驗同時進展含量測定與純度檢查，且僅使用100%的比照品，線性范圍應掩蓋雜質的報告水平至規定含量的120%。在中藥分析中，范圍應依據分析方法的具體應用和線性、準確度、周密度結果及要求確定。對于有毒的、具特別成效或藥理作用的成分，其驗證范圍應大于被限定含量的區間。溶出度或釋放度中的溶出量測定，范圍一般為限度的±30%。八、耐用性耐用性系指在測定條件有小的變動時，測定結果不受影響的承受程度，為所建立的方法用于常規檢驗供