葡萄糖生物傳感器的研究進(jìn)展

網(wǎng)絡(luò)藝術(shù)5內(nèi)固定和外包1基于生物活性物質(zhì)的傳感器葡萄糖電壓計(jì)使用固定在電極表面的葡萄糖氧化酶（go）作為識(shí)別元件，測(cè)量電壓并確定葡萄糖濃度。葡萄糖傳感器是生物傳感器中研究最多的酶電極傳感器,它可以簡(jiǎn)單并迅速地測(cè)定血糖,對(duì)糖尿病的診斷和治療有著重要的實(shí)際意義。GOD一般都易溶于水,為防止其從電極上脫落流失影響傳感器的靈敏度、穩(wěn)定性、使用壽命等性能,自1962年Clark和Lyons首先報(bào)道了基于生物傳感技術(shù)的電化學(xué)GOD生物傳感器以來(lái),人們一直在尋找良好的固定生物活性物質(zhì)的材料。納米材料由于具有比表面積大和吸附能力強(qiáng)等特點(diǎn),能夠很牢固地吸附酶等生物大分子,并且人們發(fā)現(xiàn),蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)吸附在納米材料表面仍能保持其活性。因此,近年來(lái)人們做了許多探索研究,將各種納米材料引入生物電化學(xué)傳感器中以改善傳感器的響應(yīng)性能。2零納米葡萄糖傳感器作為人們研究得最為廣泛的納米材料,零維納米材料廣泛應(yīng)用于葡萄糖傳感器中。2.1金納米顆粒固載go的傳感器金納米顆粒在葡萄糖傳感器領(lǐng)域的應(yīng)用最為廣泛,具有以下幾個(gè)特點(diǎn):(1)良好的生物相容性,對(duì)生物分子、細(xì)胞以及組織等無(wú)毒性;(2)金與帶有巰基的分子之間能夠在溫和的條件下形成穩(wěn)定的金硫鍵,這種分子可以是有機(jī)小分子,也可以是生物分子,因此很容易實(shí)現(xiàn)金納米顆粒的修飾;(3)金納米顆粒的制備方法簡(jiǎn)單,其形貌和尺寸易于調(diào)控。由于蛋白質(zhì)等物質(zhì)吸附在金納米顆粒的表面仍能保持其生物活性,因此近年來(lái)人們做了許多探索,將納米顆粒引入生物電化學(xué)傳感器中以改善傳感器的響應(yīng)性能。Crumbliss等通過(guò)電沉積將粒徑為50nm的金納米顆粒與GOD電固定在鉑絲電極上制成GOD傳感器。將該傳感器置于4℃的緩沖溶液中兩周后測(cè)試發(fā)現(xiàn)傳感器仍保持了80%的生物活性,7周后傳感器的活性基本保持在70%不變。Yabuki等通過(guò)吸附作用將GOD固定到金納米顆粒上,并將其修飾于玻碳電極,制得的GOD傳感器在0.9V(vsAg/AgCl電極)對(duì)葡萄糖有響應(yīng),響應(yīng)時(shí)間小于30s,線(xiàn)性檢測(cè)范圍為0.05—1mM。Bharathi和Wang等把溶膠-凝膠技術(shù)用于金納米顆粒固載GOD,制備的GOD電極表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性以及對(duì)葡萄糖較寬的響應(yīng)范圍。在國(guó)內(nèi),江龍教授研究組早在80年代中期就開(kāi)始將納米顆粒引入GOD生物傳感器的研究工作。他們將10—30nm的金納米顆粒用于制備GOD傳感器,并發(fā)現(xiàn)金納米顆粒的加入使酶的活性增強(qiáng),并且10nm金納米顆粒吸附酶制成的傳感器的靈敏度大大高于30nm金納米顆粒制成的傳感器,這主要?dú)w因于金納米顆粒的量子尺寸效應(yīng)和表面效應(yīng)。GOD的蛋白質(zhì)外殼都是電絕緣的,由于具有這種絕緣性,蛋白質(zhì)外殼和電活性中心很難被氧化或還原。為了能夠?qū)㈦娀钚灾行难趸蜻€原,實(shí)現(xiàn)直接電子轉(zhuǎn)移,人們引入了電子媒介體(在電極和溶液之間充當(dāng)電子媒介體)。最近,人們發(fā)現(xiàn),在納米顆粒的促進(jìn)下直接電子轉(zhuǎn)移也可以發(fā)生,而不需要額外的添加電子媒介體。納米顆粒對(duì)于電極的表面修飾將給氧化還原的蛋白質(zhì)提供一個(gè)類(lèi)似自然系統(tǒng)的微環(huán)境,并給出了蛋白質(zhì)分子更多的識(shí)別自由度,從而通過(guò)納米顆粒的導(dǎo)電通道減少蛋白質(zhì)殼對(duì)于直接電子轉(zhuǎn)移的絕緣效應(yīng)。如果納米顆粒-GOD通過(guò)簡(jiǎn)單的自組裝方法實(shí)現(xiàn)共軛連接,那么就可以得到基于納米顆粒的第三代GOD傳感器。Willner小組在這方面做了較多研究,通過(guò)將含有55個(gè)原子的金納米團(tuán)簇用N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxysuccinimide,NHS)功能化,然后將其用腺嘌呤二核苷酸輔酶(FAD)修飾,接著通過(guò)不同的雙巰基物質(zhì),將FAD-Au與金電極連接,這時(shí),再將已經(jīng)去除了FAD的GOD與上述電極作用,可以在電極表面形成催化活性良好的完整GOD(圖1)。重建的GOD的氧化還原中心與金顆粒緊密結(jié)合在一起,而金顆粒則充當(dāng)了電極與這些活化了的具有生物電催化性能的酶的電子轉(zhuǎn)移導(dǎo)線(xiàn)。近年來(lái),由于金納米顆粒優(yōu)良的生物相容性以及在電極表面呈現(xiàn)出的優(yōu)異的介導(dǎo)能力,人們發(fā)展出一系列精巧的設(shè)計(jì)方案,構(gòu)建基于金納米顆粒和GOD的各種葡萄糖生物傳感器。Sun等通過(guò)二巰基化合物連接金納米顆粒和金電極,利用色氨酸連接金納米顆粒和被高碘酸氧化的GOD,發(fā)展了GOD在金納米顆粒表面的共價(jià)固定方案,對(duì)葡萄糖的檢出限達(dá)到8.2μM。基于層層組裝技術(shù)(layer-bylayer,LBL),Yang等通過(guò)2-巰基乙胺層層連接金納米顆粒和被高碘酸氧化的GOD,構(gòu)建的傳感器對(duì)葡萄糖的檢出限達(dá)到8μM(圖2);南京大學(xué)鞠ue40a先教授課題組將GOD直接滴在碳糊和金納米顆粒的混合物上,制備出的傳感器具有簡(jiǎn)便的突出優(yōu)點(diǎn);陳洪淵教授課題組通過(guò)高電位導(dǎo)致殼聚糖沉積的方案將金納米顆粒和GOD一起沉積在金電極上制備出葡萄糖電化學(xué)傳感器。Huang等將金納米正八面體通過(guò)1,6-己二硫醇連接到金電極表面,再將GOD滴涂到修飾的電極上,最后用瓊脂糖穩(wěn)定,制備的葡萄糖傳感器具有很好的靈敏度及穩(wěn)定性。同時(shí)他們發(fā)現(xiàn),隨著修飾金納米正八面體量的增加,電極表面粗糙度也會(huì)增加,由于擴(kuò)大了比表面積,因此電極對(duì)葡萄糖的響應(yīng)電流也隨之增加。2.2ag納米顆粒作為固酶基質(zhì)的修飾銀納米顆粒同樣表現(xiàn)出極強(qiáng)的物理吸附能力,能夠吸附包括GOD在內(nèi)的具有生物活性的蛋白質(zhì)大分子;同時(shí)作為導(dǎo)電性最好的金屬,Ag納米顆粒能夠在傳感器中充當(dāng)反應(yīng)中心和電極之間的導(dǎo)線(xiàn);另外,Ag納米顆粒對(duì)GOD氧化葡萄糖之后產(chǎn)生的副產(chǎn)物過(guò)氧化氫具有優(yōu)良的催化能力。上述這些Ag納米顆粒的特殊性質(zhì)為生物大分子固定同時(shí)又能夠保持其生物活性提供了一個(gè)合適的微環(huán)境,也為固定的生物大分子與電極基質(zhì)之間的電子轉(zhuǎn)移提供了便利。因此,Ag納米顆粒是一種構(gòu)建各種類(lèi)型的生物傳感器、提高生物傳感器性能的優(yōu)良材料。作為一種導(dǎo)電性能優(yōu)良的金屬,如果將銀制成納米顆粒應(yīng)該對(duì)GOD有很好的促進(jìn)作用。然而,一直以來(lái)Ag都作為殺菌消毒劑,極低濃度的Ag+就對(duì)GOD有抑制作用,而在制備Ag納米顆粒的過(guò)程中,Ag+不能完全被消耗,所以新制備的Ag納米顆粒不僅不能直接用于修飾GOD,反而會(huì)抑制GOD的活性。江龍教授課題組使用不同放置時(shí)間的新制備的Ag納米顆粒對(duì)GOD進(jìn)行修飾,并用戊二醛進(jìn)行交聯(lián),最后用殼聚糖固定(圖3所示)。研究表明,放置時(shí)間小于30h的Ag納米顆粒對(duì)GOD有抑制作用,而放置時(shí)間大于30h時(shí),Ag納米顆粒有很好的促進(jìn)作用,并在150h時(shí)達(dá)到最大。這說(shuō)明,單純的銀納米顆粒具有良好的生物相容性。唐芳瓊教授課題組將超細(xì)Ag納米顆粒作為固酶基質(zhì)應(yīng)用于GOD生物傳感器的制備,以改善酶電極電流響應(yīng)性能。在其他固酶條件相同的情況下,加入Ag納米顆粒后的酶電極響應(yīng)電流提高了約40倍。其他小組對(duì)Ag納米顆粒GOD生物傳感器也進(jìn)行了一些研究。袁若教授課題組將穩(wěn)定的聚亞甲基藍(lán)膜通過(guò)循環(huán)伏安電聚合到玻碳電極上,并將GOD吸附到Ag納米顆粒上,用聚乙烯醇縮丁醛作為酶輔助固定劑將其固定到PMB/GC電極上。得到的葡萄糖傳感器具有較短的響應(yīng)時(shí)間、較高的靈敏度以及較好的穩(wěn)定性。葡萄糖的線(xiàn)性范圍2.5—2000μM,檢出限1.0μM。該傳感器具有很低的工作電壓從而可以有效排除尿酸和抗壞血酸的干擾。Lan等使用修飾有Ag納米顆粒摻雜的硅膠-凝膠將GOD固定到通過(guò)普魯士藍(lán)修飾的絲網(wǎng)印刷電極上(圖4)。該電極對(duì)葡萄糖的線(xiàn)性檢出范圍為12.5μM—2.56mM,檢測(cè)靈敏度為20.09m·M-1·cm-2。被固定的GOD儲(chǔ)存30天后,仍能維持原活性的91%。2.3sio和au復(fù)合納米顆粒唐方瓊教授課題組利用Cu納米顆粒作固酶基質(zhì),發(fā)現(xiàn)Cu納米顆粒也可大幅度提高固定化酶的催化活性,使酶電極的響應(yīng)電流從相應(yīng)濃度的幾十納安增強(qiáng)到幾千納安。江龍教授課題組研究發(fā)現(xiàn),將憎水納米SiO2作為固酶材料可以保持GOD的活性,延長(zhǎng)酶電極的壽命。他們將SiO2和Au組成的復(fù)合納米顆粒用于固載GOD,構(gòu)建GOD生物傳感器。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,其效果明顯優(yōu)于這兩種納米顆粒單獨(dú)使用時(shí)對(duì)GOD電極響應(yīng)性能的增強(qiáng)作用。除上述納米材料以外,鉑納米顆粒也因具有對(duì)H2O2特殊的電催化能力而廣泛用于葡萄糖傳感器的制備。零維納米材料覆蓋在電極表面,其大的比表面積使得電極的有效面積大大增加,從而可以顯著增強(qiáng)傳感器的靈敏度,獲得極低的檢出限。31納米納米顆粒近年來(lái)一維納米材料(如納米線(xiàn)、納米管等)應(yīng)用于GOD傳感器的研究越來(lái)越多[35—37]。3.1葡萄糖的檢測(cè)Zhang等通過(guò)氧化鋁模板法制備了多孔的和實(shí)心的金納米線(xiàn),并比較了兩者在修飾GOD后對(duì)葡萄糖的檢測(cè)能力。實(shí)驗(yàn)表明,多孔金納米線(xiàn)具有與GOD更好的結(jié)合能力和對(duì)H2O2更好的催化能力,由此制得的第一代GOD傳感器只需要5s的響應(yīng)時(shí)間,而線(xiàn)性范圍在50μM—20mM,相關(guān)系數(shù)為0.99906,檢出限為46μM。同時(shí),在低電勢(shì)下,可以排除尿酸和抗壞血酸等影響,通過(guò)檢測(cè)GOD催化葡萄糖的產(chǎn)物H2O2來(lái)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)葡萄糖的目的。Wang等制備了長(zhǎng)20μm、直徑為200nm的金鎳納米線(xiàn)。這種納米線(xiàn)具有磁性,可由外界的磁鐵控制納米線(xiàn)的方位(圖5所示)。在納米線(xiàn)金端修飾上GOD,通過(guò)磁鐵控制納米線(xiàn)與表面修飾有二茂鐵衍生物的金電極接觸的方式,發(fā)現(xiàn)平躺情況下得到最大的相應(yīng)電流。此法實(shí)現(xiàn)了對(duì)葡萄糖測(cè)量的可控性,通過(guò)外界的宏觀(guān)操作就可調(diào)節(jié)葡萄糖測(cè)量的方式,具有操作簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn),并且能夠達(dá)到很好的檢出限和線(xiàn)性范圍。俞汝勤教授課題組利用聚碳酸酯膜,通過(guò)電沉積法制備金納米線(xiàn)(圖6)。在玻碳電極表面滴涂殼聚糖,水分揮發(fā)后,滴上金納米線(xiàn)和GOD孵化過(guò)夜的混合物,制備出葡萄糖傳感器。由于金納米線(xiàn)具有良好的催化能力、電性能和導(dǎo)電性,因此制得的傳感器對(duì)H2O2有很好的檢測(cè)能力,對(duì)葡萄糖的檢測(cè)限達(dá)到5μM,并具有很好的重現(xiàn)性,30天后仍能保持初始電流的80%。唐芳瓊教授課題組將GOD與金納米棒的混合物滴涂在鉑電極上,再用戊二醛交聯(lián),最后使用混有金納米棒的醋酸纖維素固定。此法可以不需要電子媒介體直接對(duì)葡萄糖進(jìn)行檢測(cè)。該傳感器對(duì)葡萄糖濃度具有很好的線(xiàn)性電流關(guān)系,并具有很好的重現(xiàn)性,一個(gè)月后仍能保持初始電流的80%。Hrapovic等通過(guò)電化學(xué)刻蝕和電化學(xué)共沉淀固定化酶,制備了單根納米鉑絲生物傳感器,在對(duì)葡萄糖含量的檢測(cè)中背景電流低于1×10-12A,響應(yīng)時(shí)間僅為2s,檢測(cè)下限達(dá)到20μM。3.2葡萄糖生物傳感器Azamian等將CNT修飾電極浸入GOD溶液中,利用偶聯(lián)劑EDC將CNT和GOD連接,成功將GOD固定在單壁碳納米管(SWNTs)上(圖7,有GOD覆蓋的SWNTs要明顯粗于未覆蓋的),制得GOD-SWNTs復(fù)合電極。結(jié)果發(fā)現(xiàn),對(duì)相同葡萄糖濃度,GOD-SWNTs玻碳電極的催化響應(yīng)電流是GOD玻碳電極的十倍以上。這表明CNT不僅能夠負(fù)載足夠多的GOD,而且對(duì)電子的傳遞能力也非常強(qiáng)。Tsai等將Nafion、MWCNT、GOD制成薄膜并修飾在玻碳電極上,制得一種復(fù)合膜GOD傳感器,他們系統(tǒng)研究了該傳感器的理化性質(zhì)與葡萄糖傳感增強(qiáng)效果。Lin等通過(guò)化學(xué)處理CNT表面得到—COOH末端,并將—COOH用活化劑活化與GOD的—NH2反應(yīng)將GOD固定在CNT表面,制備了GOD傳感器(圖8)。Joshi等將具有氧化還原性質(zhì)的含元素鋨(Os)的聚合物、GOD與SWNTs組成的復(fù)合物修飾電極,制備了葡萄糖的電化學(xué)傳感器,SWNTs和Os聚合物的加入對(duì)傳感效果具有明顯的增強(qiáng)效應(yīng)。Kim等將CNT用濃硫酸/濃硝酸處理,活化羧基后,連接通過(guò)戊二醛交聯(lián)的GOD,制成一種可以隨意涂覆到各種工作電極上的酶料涂層,得到的GOD傳感器能夠保持響應(yīng)電流不變達(dá)200天。該涂層還可以應(yīng)用到對(duì)生物材料壽命要求較高的生物燃料電池等領(lǐng)域。Zhang等通過(guò)將CNT分散到殼聚糖溶液中,得到了一個(gè)具有良好生物相容性的制備生物傳感器的平臺(tái)。Liu等在上述體系中固定GOD,觀(guān)察到了酶和電極之間直接電子轉(zhuǎn)移的證據(jù),得到了性能優(yōu)良的第三代GOD傳感器。Hrapovic等將CNT與直徑為2—3nm的鉑納米顆粒復(fù)合并將該復(fù)合物分散到Nafion溶液中,再修飾于玻碳電極上,制備了GOD傳感器。這種傳感器對(duì)葡萄糖具有極高的響應(yīng)速度和靈敏度,在0.15μM—5mM濃度范圍內(nèi)具有線(xiàn)性響應(yīng)關(guān)系,相關(guān)系數(shù)高達(dá)0.998,靈敏度高達(dá)2111μA·mM-1,檢出限0.15μM。Zeng等通過(guò)多氨基枝狀化合物(dendrimer)修飾MWCNT,制備了高效的葡萄糖生物傳感器(圖9)。該課題組還把亞鐵氰化鈷與CNT和殼聚糖組裝起來(lái),利用CNT極佳的電子轉(zhuǎn)移能力,大大提高了亞鐵氰化鈷的氧化還原活性,制得的葡萄糖生物傳感器可以在-0.12V(vsSCE)電壓下工作,避免了溶液中電活性物質(zhì)的干擾。Manesh等采用靜電紡絲的方法,把包裹了MWCNT的聚陽(yáng)離子電解質(zhì)(PDDA)和聚甲基丙烯酸甲酯制成納米纖維膜,在膜上固定GOD得到了一種新型的葡萄糖傳感器,具有很寬的線(xiàn)性范圍和良好的選擇性、穩(wěn)定性及重復(fù)使用性能。段大雪等借助CNT以及鉑納米顆粒制備了檢測(cè)葡萄糖的生物傳感器,該傳感器穩(wěn)定性好、響應(yīng)速度快。毛蘭群教授研究組將甲基咪唑通過(guò)環(huán)氧乙烷聚合到羧基化的CNT上,并將其滴涂在玻碳電極上,然后將電極浸入鐵氰化鉀溶液,利用甲基咪唑鹽所帶的正電吸附帶負(fù)電的Fe(CN)63-,最后將GOD和BSA的混合物覆蓋在電極上,得到的葡萄糖傳感器線(xiàn)性范圍為0.05—0.5mM,檢出限達(dá)到了0.01mM(S/N=3)(圖10)。一維納米材料的特殊形貌為GOD傳感器的設(shè)計(jì)提供了很多便利,并由此出現(xiàn)了許多新型的GOD傳感器。另外,由于碳材料的特性,在CNT材料表面進(jìn)行化學(xué)修飾變得非常容易,因此將GOD直接與CNT進(jìn)行共價(jià)鍵連接使得固酶效果和傳感性能都得到顯著提高。再者,CNT作為一種碳材料,具有良好的生物相容性,與細(xì)胞直接接觸不會(huì)產(chǎn)生毒性,用CNT修飾的GOD傳感器往往能夠大幅提高傳感器的重現(xiàn)性和壽命。4金屬銀納米顆粒修飾的葡萄糖傳感器二維納米材料具有其自身特殊的物理與化學(xué)特性,因此在生物傳感器設(shè)計(jì)的過(guò)程中被廣泛使用。近年來(lái)石墨烯在傳感器中的應(yīng)用受到了人們的關(guān)注。Shan等通過(guò)離子液體功能化將石墨烯應(yīng)用于葡萄糖傳感器,該傳感器表現(xiàn)出很寬的線(xiàn)性范圍(2—14mM,R=0.994)、良好的重現(xiàn)性(在-0.5V條件下對(duì)6mM葡萄糖進(jìn)行10次連續(xù)測(cè)量可以得到3.2%的相關(guān)系數(shù))以及非常好的穩(wěn)定性(一周以后電流響應(yīng)保持在95%)。Lu等利用Nafion固定鱗片狀石墨納米片,并將GOD修飾于其上,得到的葡萄糖傳感器具有高靈敏度(14.17μA·mM-1·cm-2)、較短的響應(yīng)時(shí)間(5s)以及極低的檢測(cè)限(10μM)和寬的線(xiàn)性監(jiān)測(cè)范圍(~6mM)。他們將Pt和Pd納米顆粒修飾于鱗片狀石墨納米片上,并用Nafion固定納米顆粒和納米片,再修飾GOD,得到的葡萄糖傳感器各項(xiàng)性能得到很好的改善:檢測(cè)靈敏度61.5μA·mM-1·cm-2,響應(yīng)快速(2s),檢出限1μM。由于鱗片狀石墨納米片簡(jiǎn)單易得,所以它是一種很好又很經(jīng)濟(jì)的制備葡萄糖傳感器的材料。我們課題組通過(guò)將三角形銀納米顆粒(AgTNPs)與殼聚糖和GOD進(jìn)行混合,用戊二醛進(jìn)行交聯(lián)以防止GOD泄漏,并將該混合物蘸涂到鉑電極上,在空氣中風(fēng)干,制備出的傳感器對(duì)葡萄糖具有高靈敏性(67.17μA·cm-2m·M-1),寬線(xiàn)性檢出范圍(3μM—3mM),低檢出限(1μM)。在該傳感器中,AgTNPs對(duì)檢測(cè)性能的改善起到了決定性作用(如圖11—13)。AgTNPs具有良好的生物相容性,因此GOD吸附在AgTNPs表面,仍能夠很好地保持活性(圖11)。同時(shí)由于具有高導(dǎo)電能力,因此AgTNPs還能夠促進(jìn)GOD與電極表面的電子轉(zhuǎn)移。另外,Ag納米顆粒對(duì)H2O2有催化能力,在該傳感器中也得到了體現(xiàn):與不含AgTNP