基于rdnais序列分析的杜鵑菌根真菌分類研究

杜鵑花不僅是世界著名的觀賞植物，也是中國傳統十大植物之一。杜鵑花科幾個屬的植物根系常與一些土壤真菌形成一種特殊類型的內生菌根共生體,即歐石南類菌根(ericoidmycorrhiza,ERM)(Read1996),也稱為杜鵑花類菌根。目前已知形成杜鵑花類菌根的真菌主要是子囊菌,包括石楠柔膜菌Hymenoscyphusericae(Read)Korf&Kernan及樹粉孢屬真菌Oidiodendronsp.和磚隔腔菌Caproniasp.等一些真菌類型。錦繡杜鵑Rhododendronpulchrum是長三角地區常見杜鵑花栽培類型,適應性強且生長迅速。為了研究錦繡杜鵑根系內生真菌的多樣性,對上海及周邊地區5個樣地的錦繡杜鵑根系內生真菌進行分離和培養,獲得了大量的真菌菌株。由于大部分菌株在純培養條件下不能形成孢子,在形態上很難對其分類地位進行鑒定。楊兵等(2010)曾使用ITS-RFLP分子標記對分離的錦繡杜鵑根系內生真菌進行鑒定,但是主要類型的分類地位沒有確定。本文選擇出現頻率較高的幾種形態類型的真菌,接種云錦杜鵑無菌播種苗4個月后檢測根系菌根侵染率,初步確定這些菌株是否為菌根真菌,并對已確定為菌根真菌的菌株進行ITS序列測定,從分子水平上對錦繡杜鵑根系的幾種菌根真菌進行鑒定。同時測量接種播種苗與未接種播種苗的生長量,分析接種效應,為今后優良菌株的篩選準備基礎資料。1材料和方法1.1材料表面1.1.1保濕的配制采集上海及周邊地區樣地的錦繡杜鵑的生活根,連同泥土保濕放置于4℃冰箱,待用。云錦杜鵑Rhododendronfortunei種子無菌處理后播種在1/2Read培養基上,長出第一片真葉時用于菌株接種。1.1.2基本培訓分離培養基和鑒定培養基分別使用馬丁-孟加拉紅培養基(MA)和麥芽提取物培養基(MEA)(楊兵等2010)。1.1.3草炭/防止砂膠菌菌劑為5d煤質培養基挑取菌落接種在MEA固體培養基上,25℃黑暗培養15d,作為菌劑。接種基質為過1mm篩的草炭和蛭石按體積比1:1的混合物;121℃滅菌1h以上,無菌分裝待用。1.2方法1.2.1消毒、培養清洗和挑選健康的生活根,用72%乙醇沖洗后,放入10%家用84消毒液表面消毒15-20min,無菌水沖洗3-5遍后,剪切成0.3-0.5cm長的根段,每個培養皿中放置5個根段,然后置于25℃培養箱中黑暗培養2-4周(張春英等2007)。1.2.2形態差異穩定性觀察將從根段中長出的菌落用牙簽挑取至MEA培養基中,培養2周后肉眼觀察菌落形態的一致性和均勻性,若有形態差異,進行2次分離,3周后對菌落形態特征穩定的菌株觀察記錄。菌落形態特征的描述依據Mcleanetal.(1999)和Johansson(2001)的方法,指標包括菌落直徑、顏色、質地、是否有液體分泌物、邊緣、菌落外形等。1.2.3pcr產物的純化和測序菌株培養使用MEA培養基,25℃、150r/min振蕩培養7-10d,過濾收獲菌絲作為真菌總DNA提取的材料,總DNA提取采用OMEGA公司的FungalDNAKit(200)試劑盒。rDNAITS區段的PCR擴增采用通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。PCR反應體系為2×PCRTaqMix25μL,引物各2μL(10μmol/L),模板DNA2μL,用超純水定容至50μL。PCR反應條件:95℃預變性2min;然后94℃變性40s,60℃退火40s,72℃延伸45s,72℃補平5min,共進行35個循環。PCR產物純化后直接測序,測序儀器為ABI3730Xl(測序工作由上海英駿生物技術有限公司完成)。ITS序列使用ClustalX1.83和BioEditv7.05軟件進行分析,運用MEGA3.1計算各序列間的遺傳距離;實驗獲得的ITS序列及其在GenBank中下載的最相似序列,使用MEGA3.1軟件基于Kimura雙參數模型構建Neighbor-Joining系統發育樹,經bootstrap1,000次循環檢驗系統樹的可靠性。1.2.4菌株/苗高、干重、成活率測定采用單層基質接種法(張春英等2010)并稍做修改,選擇生長健壯、長勢一致的云錦杜鵑播種苗株移栽至準備好的無菌瓶中,每瓶4棵,2棵之間接入一塊直徑約3mm的菌塊。每處理3瓶,并設置不接種對照,于25℃,濕度65%的氣候箱內培養4個月。菌根侵染率檢測方法:采用錐蟲藍染色法進行檢測,在40倍雙目解剖鏡下觀察幼根表皮及皮層細胞中是否有菌絲結或菌絲。根據以下標準進行分類:1級:受感染的營養根占觀察總根數的0-5%;2級:受感染的營養根占觀察總根數的6%-25%;3級:受感染的營養根占觀察總根數的26%-50%;4級:受感染的營養根占觀察總根數的51%-75%;5級:受感染的營養根占觀察總根數的76%-100%。菌根依賴性(mycorrhizaldependence,MD)=接種植株平均干重/對照植株平均干重×100%(弓明欽等2000)生物量測量方法:4個月后對全部處理幼苗測定苗高、干重、成活率。采用SAS軟件進行數據方差分析。2結果與分析2.1菌株的感染情況16個菌株的形態特征可分為9個類型(表1),不同類型的菌株生長速度差異較大。MEA培養基上接種3周后,生長最快的菌株菌落直徑可達40mm,最慢的僅有7mm;菌落顏色深淺不一,有白色、乳白色、棕色、灰色、黑色等;質地多為絨氈狀,少絨毛狀;多數菌落沒有液體分泌物;菌落中心多隆起。16個菌株的接種苗根系內均觀察到侵染細胞,但菌根侵染率有差異(表2和圖1)。菌株的菌根侵染率都在20%以上,其中28號菌株的菌根侵染率最高為56%,屬4級侵染;其次是BJF-14菌株,屬3級侵染;其余菌株的侵染率在21%-25%之間,均屬2級侵染。根據檢測結果初步確定16個菌株均為杜鵑花類菌根真菌。對照植株根系沒有檢測到菌絲的侵染。2.2pcr擴增結果實驗共提取了16個菌株的菌絲體總DNA,均獲得了較高質量的總DNA片段,PCR擴增均得到了單一的ITS片段(圖2、圖3);經PCR產物直接測序,獲得了16個菌株的rDNAITS區段的序列。2.3ntara及其序列分析2.3.1粒徑及形態類型16個菌株的ITS序列長度范圍在533-724bp之間(表3)。空位作為缺失處理時,16個菌株ITS全序列經ClustalX1.83軟件排序后的最長長度為727bp。依據GC含量及序列全長將16個菌株分為3組:HZT-15等7個菌株為組1,包括菌落形態類型6、7、8和9;NBTH-45和NBT-1為組2,即菌落形態類型5;其余7個菌株為組3,包括菌落形態類型1、2、3和4。2.3.2菌株同源性分析根據16個菌株的ITS序列相似性和遺傳距離矩陣(表4),組1各菌株間的序列相似度很高,為0.950-0.987,遺傳距離為0.0000-0.0097,表明組1內菌株之間的同源性很高;組2兩個菌株間的序列相似度為0.884,遺傳距離為0.0039,說明菌株NBTH-45和NBT-1之間同源性比較高;組3內菌株間序列相似度和遺傳距離變化較大,分別在0.753-0.970和0.0000-0.0955之間,說明組3內有些菌株之間同源性較高,有些同源性較低。3個組之間序列相似度低,遺傳距離也較遠,表明不同組菌株之間同源性低,同時說明依據ITS序列長度和GC含量的分類具有一定的可靠性。2.3.3菌株間的親緣關系基于各菌株及相似真菌的ITS序列構建了NJ系統發育樹(圖4)。16個菌株在NJ樹上聚為3大支:菌落類型6、7、8和9的7個菌株與樹粉孢屬Oidiodendronsp.類真菌聚為一類,并得到100%的支持率,序列相似率也在98%-99%之間(表5),但出現了小分支且支持率都不高,表明這7個菌株雖與樹粉孢屬真菌O.maius或O.citrinum親緣關系很近,但不是O.maius或O.citrinum同源種,可能屬于樹粉孢屬Oidiodendronsp.的不同菌種;菌落類型5的菌株NBTH-45和NBT-1與未命名的云錦杜鵑根系內生真菌聚為一類,序列相似率在97%-98%之間,也得到100%的支持率,說明此類型真菌與某些云錦杜鵑根系真菌親緣關系很近,可能為同種或近緣種;菌落類型1、2、3和4的7個菌株以98%的支持率與一些杜鵑花科植物的未命名的菌根真菌聚為一類,序列相似率在93%-97%之間,其中包含了3個小分支,類型4的真菌在89%的支持率上與分離自云錦杜鵑的未命名菌根真菌mycorrhizalfungalspecies聚為一起且序列相似率為97%,說明此類真菌與云錦杜鵑菌根真菌具有同源性。類型1、2和3的一些真菌與其他杜鵑花類菌根真菌ericoidmycorrhizalsp.、epacridrootendophyte、mycorrhizalascomyceteofRhododendron聚為一起,均獲得了較高的支持率和序列相似率,說明該類真菌與分離自其他杜鵑花科植物、尖苞樹科Epacridaceae植物的菌根真菌具有較近的親緣關系和較高的同源性。2.4菌株對幼苗生長的影響16個菌株的云錦杜鵑接種苗根系均觀察到菌根侵染細胞,而且從接種幼苗的生長量上看(表6),所有菌株均能促進幼苗的生長,62%接種幼苗生長量與對照相比達到顯著水平。但不同菌株對幼苗生長量的促進效應有差異,如22和25號菌株接種幼苗與對照非接種苗株高差異顯著,而干重則不顯著;ZT-13和28號菌株接種幼苗與對照在株高和干重上都差異顯著。同類型菌株對幼苗的促進效應也不同,如同為Oidiodendronsp.的HZT-29、BJO-8和ZT-13號菌株,HZT-29接種幼苗與對照在株高和干重上均沒有顯著差異,BJO-8接種幼苗與對照株高差異顯著,干重沒有差異。根據菌株依賴性的劃分標準(弓明欽等2000),16個菌株中有7個菌株的菌根依賴性小于200%,為弱依賴性;4個小于300%,大于200%,為中等依賴性;5個大于300%,為強依賴性。3討論3.1云錦松茸對重組菌根的侵害實驗中,由于錦繡杜鵑無種子且組培快繁速度較慢,而云錦杜鵑比較容易獲得無菌播種苗,所以選擇云錦杜鵑播種苗作為接種寄主進行菌株功能鑒定。16個菌株的云錦杜鵑接種苗根系內均觀察到菌根侵染細胞,表明這些菌株均為杜鵑花類菌根真菌。但菌根侵染率普遍較低,可能是由于試驗所用的菌株分離自錦繡杜鵑,對云錦杜鵑侵染性有所降低所致,尹麗娟等(2010)在接種效應研究中也發現類似現象。16個菌株均表現出對云錦杜鵑幼苗生長的促進作用,而且不同菌株接種效應有差異,該結果證實了菌根真菌對杜鵑花生長的有益性以及高效菌株篩選的必要性。3.2不同菌株的培養和分離根據ITS序列分析,錦繡杜鵑根系主要菌根真菌分為三個類型。一類為樹粉孢屬真菌Oidiodendronsp.。樹粉孢屬真菌是杜鵑花科植物常見菌根真菌,且杜鵑花屬Rhododendron植物根系中分離出的樹粉孢菌多為O.maius的菌株(Usukietal.2003;Bougoure&Cairney2005;張春英和戴思蘭2008;Zhangetal.2009)。實驗中有7個菌株被鑒定為樹粉孢屬Oidio