糖蛋白的提取分離純化與表征摘要：糖蛋白是由寡糖鏈與多肽鏈共價連接而成的一類結合蛋白質，是一類重要的生物大分子，在生物體內占有重要地位。本文綜述了糖蛋白的分類、分離純化及純度鑒定方法研究，并介紹了某些糖蛋白的生理活性，對糖蛋白的開發利用具有借鑒作用。關鍵詞：糖蛋白，提取，分離純化，純度鑒定，生物活性1糖蛋白的簡介1.1糖蛋白的定義糖蛋白是由小于15個單糖單位的寡糖鏈與蛋白質以共價鍵連構成的復合分子，在組成上以蛋白質為主。與其他大分子相比，糖蛋白的定義一直比較模糊，直至1908年美國生物化學家協會首次將糖蛋白定義為：由蛋白質分子和除核酸外的含有碳水化合物基團的物質共同組成的復合物(compoundsoftheproteinmoleculeswithasubstanceorsubstancescontainingacarbohydrategroup,otherthannucleicacid)(Montreuileta1.,1995)。糖含量在不同糖蛋白中差別較為明顯，通常情況下，總糖含量占蛋白重量的1％-60％不等，舉幾個例子：膠原蛋白含糖量一般不到1%,免疫球蛋白G低于4%,人紅細胞膜的血型糖蛋白含糖量在54%左右。隨著糖和蛋白復合物領域研究的逐步深入,研究者將蛋白聚糖和糖蛋白區別開來,糖蛋白專指由比較短(通常不會超過15個單糖單位)、通常情況下具有多個分支的寡糖鏈與多膚鏈以共價鍵相連接的,含量上以蛋白為主的復合物；而蛋白聚糖在組成上以糖為主,且其糖鏈類型和連接方式均與糖蛋白有區別。近年來,糖蛋白的研究成為多門學科的研究前沿領域。相關研究者在醫藥學、生物化學、細胞生物學、免疫學以及食品科學領域都滲透進了糖蛋白的相關研究。1.2糖蛋白的分類及分布糖蛋白的主要由糖鏈和肽鏈兩大部分構成。構成糖蛋白的單糖主要有(陳惠黎主編,1997)：葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖、N-乙酞葡萄糖胺、以及糖醛酸等。糖蛋白中較短的糖鏈和較長的肽鏈是通過糖肽鍵共價連接的。糖蛋白中按糖肽鍵連接方式不同糖蛋白可分為N-連接型糖鏈和0-連接型糖鏈，(1)N-連接型糖鏈糖蛋白：其特點是以天冬酞胺的酞胺基、N-末端氨基酸a-氨基以及賴氨酸或精氨酸-氨基為連接點，形成N-糖苷鍵型糖肽鍵，此類型糖蛋白糖鏈一般由以G1cNAc6為還原端,由六個到十個糖基構成；(2)0-連接型糖鏈糖蛋白：其結構特點是以蘇氨酸、絲氨酸、和羥賴氨酸的輕基為連接點，形成0-糖昔鍵型。在自然界中，糖蛋白以各種形式存在于細胞間質、細胞膜、血液及粘液中，包括許多激素、免疫球蛋白、粘液、結構蛋白、受體組分等。1.3糖蛋白生物學功能糖蛋白及其復合物是一類重要的生物活性物質，糖蛋白作為一種糖和蛋白質的復合物，具有多方面的生物活性，如抗氧化、免疫調節作用、體外抗腫瘤活性、抗糖尿病活性等，糖蛋白它可以存在于植物的細胞中，也可以存在于動物和微生物的細胞中，具有開關和調諧功能、激素功能、胞內轉運功能、保護與促進物質吸收、參與血液凝固、參與細胞識別一系列作用。2糖蛋白的提取糖蛋白的提取就是將糖蛋白從原料中分離出來的過程。包括以下幾個階段，材料的選擇和預處理，細胞的破碎，提取，濃縮，沉淀，干燥。糖蛋白是一類結合蛋白，兼有多糖和蛋白質的某些性質，大多可溶于水及稀鹽、稀酸和稀堿溶液等，因此可根據需要采用不同的溶劑提取分離糖蛋白。但要注意，在所有這些步驟中必須保證糖蛋白生物大分子的完整性，防止過酸、過堿、有機溶劑、高溫、劇烈機械作用等破壞糖蛋白的結構而導致目的產物的生物活性喪失。常用的提取方法有：水提取法、稀鹽溶液或緩沖液浸提法、酸堿溶液提取法、酶解法提取等。水提取法由于糖蛋白中糖鏈的高度親水性(組成膜的糖蛋白除外)，因此可用不同溫度的水提取糖蛋白。有時在提取之前需要對原料進行脫脂處理，常用的方法是醚或醇回流。有報道，將藤壺全臟器勻漿，稱取100g,加入600mL蒸餾水，于60°C下浸提4h,8層紗布過濾離心(12000r?min-1,20min，4C,以下離心條件皆相同)，濃縮，無水乙醇沉淀24h，離心，沉淀凍干等步驟獲得糖蛋白質粗品［1］;稱取印尼白燕盞燕窩粉末0.2g，加入20mL蒸餾水，60C浸提6h，10000rpm離心20min取上清液，重復提取三次，合并提取液，凍干得燕窩糖蛋白粗品⑵；取黃芪藥材，粉碎成絮狀，取一定量加水浸泡12h,于＜55C水浴浸提2次，合并提取液，過濾，濾液離心(3000r?min-1,30min,下同)，濃縮上清液，力加(NH4)2SO4至過飽和，于4C靜置過夜，離心，取沉淀，加適量水溶解，經sevage試劑脫蛋白，重復3次，直至無變性蛋白，將上清液置于透析袋透析，冷凍干燥，即得黃芪糖蛋白(AmGP—2)粗品［3］；稱取一定量的懷山藥片，加適量水，組織搗碎機粉碎后，在熱水浴中浸提，離心，收集上清液，減壓濃縮。加入氯仿：正丁醇=4：1(V/V)的Sevage試劑，以充分去除脂質、游離蛋白質，然后樣液取水層透析，收集透析袋內液，離心，上清液即是山藥糖蛋白粗品液［4］。稀鹽溶液或緩沖溶液浸提法糖蛋白在稀鹽溶液和緩沖溶液中穩定性好、溶解度大，這兩種溶液是提取糖蛋白最常用的溶劑。有報道，將藤壺全臟器勻漿，稱取500g,4C下以2000mL0.2moL?L-1(pH7.4)的磷酸鹽緩沖溶液浸提12h，上清液以硫酸銨鹽進行分級沉淀，分別使硫酸銨含量達到40%、60%、100%三個級別，每級沉淀3h,離心，透析，凍干等步驟獲得了糖蛋白的粗品［1］；稱取黃芪粉末100g，以10倍量Tris緩沖液：Tris-HCI(25mMpH8.0)-NaCI(50mM)溶解，55C浸提lh,紗布過濾，濾渣再以8倍量Tris緩沖液浸提lh后，紗布過濾，合并第一次濾液；離心取上清液，透析，冷凍干燥得粗蛋白質粗品。黃芪粉碎過二號篩，加10倍量的pH8.0TrisCl(25mM)-NaCl(50mM)緩沖液，55C水浴浸提lh,4200r/min的離心30min,取上清液棄去藥渣，上清液4C10000rpm離心20min,二次離心后上清液冷凍干燥，即得黃芪粗品糖蛋白⑸；藤壺全臟器勻漿，稱取50g,加入1.5moL?L-1NaCl溶液600mL,微波輔助提取(40C,360Hz,200W,9min),過濾，離心，梯度透析，凍干等步驟獲得了糖蛋白粗品1］；配制質量濃度為l%的紫芝胞外多糖蛋白復合物粗品溶液，冰浴中磁力攪拌器攪拌下分段緩慢加入(NH4)2SO4粉末至90%飽和度。4C靜置過夜，10000rpm冷凍離心10min,分別收集上清和沉淀，依次經蒸餾水和三蒸水透析除鹽，冷凍干燥，得到上清的粗品EP及90%(NH4)2SO4鹽析的沉淀樣品［6］。酸堿溶液提取法由于糖蛋白兼具糖和蛋白質的性質，因此可根據蛋白質等電點法進行分離，若所含蛋白質偏酸性可采用堿提法分離，反之則用酸提法進行分離。同時也可根據糖鏈中0-連接的糖苷鍵在堿溶液作用下發生B-消除反應的性質采用堿提法分離糖蛋白，提取過程中可充注氮氣或者加入適量的硼氫化鈉來防止糖蛋白降解。有報道，用堿提法提取了魷魚纏卵腺Mucin型糖蛋白，提取率約為5%，其中蛋白含量22.6%，糖含量73.1%，硫酸根含量4.3%。采用酸堿溶液提取法提取過程中應注意對溶液pH的控制，溶液過酸過堿而造成的糖蛋白結構破壞［7］。2.4酶法提取糖蛋白對于難溶性糖蛋白，則可采用酶法提取，將不溶性的糖蛋白分解為可溶性的糖肽、游離肽或氨基酸。酶具有專一性，可以選擇性地除去雜質。因而酶法提取也是糖蛋白制備過程中常用的方法。方旭波等用胰蛋白酶和木瓜蛋白酶配合輔助提取了阿根廷魷魚喉軟骨中白色纖維狀的硫酸軟骨素糖蛋白，其中軟骨素含量95.31％，蛋白含量2.59％［8］。糖蛋白的分離與純化從細胞中提取得到的生物大分子往往是不純凈的，含有大量雜質，必須進一步分離純化。這一階段可分為粗分級分離和細分級分離兩步進行。粗分級分離是將粗蛋白中的非糖蛋白組分除去，一般采用的脫蛋白方法為sevag法和硫酸銨分級法。此步主要是為了去除大量的游離蛋白和多糖，多糖不僅影響糖蛋白的SDS電泳還干擾糖蛋白的純化、鑒定。一般蛋白質樣品經粗分級后，體積較小，雜質大部分被除去。細分級分離就是進一步將蛋白質混合物中的目的單一組分分離出來，通常使用高分辨率的膜分離，纖維素離子交換柱層析法、凝膠柱層析法和親和層析法。另外，因為只有活性的蛋白質才是我們需要的，在上述分離提取過程中，由于攪拌、升溫、pH變化等使得維持蛋白質高級結構的氫鍵，疏水相互作用等弱的作用力不能再保持蛋白質的穩定構象，從而失去活性。失去活性的蛋白質就是雜質，不僅無用，有時還有毒。所以在上述分離提取步驟中有時有必要采取一些保護蛋白質活性的措施。如添加蛋白質穩定劑糖類，聚乙二醇等；或優化操作條件，如避光，溫和的pH條件，低溫等。下面以紫紅薯的糖蛋白的分離純化為例來說明糖蛋白的分離純化的具體步驟。研究者將得到的紫紅薯糖蛋白粗品利用了兩種分離純化方法的到紫紅薯的糖蛋白純品：先離子層析法，后用凝膠過濾層析法［9］。紫紅薯糖蛋白的DEAE-52纖維素柱層析:將處理好的DEAE-52纖維素濕法裝柱(①1.5cmX33cm),柱高為25cm,用Tris-HCI緩沖液平衡柱床。粗糖蛋白粉末用雙蒸水配成5mg/mL溶液，吸取10毫升溶解液緩慢地加到纖維素柱面，然后分別用0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50mol/L的NaHCO3進行分階段洗脫，流速為1mL/min，在280nm處紫外檢測器，自動部分收集器收集，每5min收集一管，用考馬斯亮藍法測定在595nm下的吸光度和苯酚.硫酸法檢測在490nm處吸光度，收集蛋白質和多糖重疊峰的洗脫液，4°C透析后真空冷凍干燥得到粗糖蛋白。葡聚糖凝膠SephadexG-75層析：將處理好的SephadexG-75濕法裝柱(①1.5cmX33cm),柱高為25cm,用蒸餾水洗滌平衡柱床，將經DEAE-52纖維素純化過的粗糖蛋白用蒸餾水配制成10mg/mL，上樣量為1mL，用雙蒸水進行洗脫，流速為1mL/min，在紫外檢測器280am處時出現峰時開始收集，每5min收集一管，用考馬斯亮藍法測定在595nm下的吸光度和苯酚.硫酸法檢測在490nm處吸光度，收集蛋白質和多糖重疊峰洗脫液，4C透析后冷凍干燥較純糖蛋白粉末樣品。糖蛋白的含量測定糖含量的測定:采用苯酚-硫酸法測定糖蛋白中的總糖含量。蛋白質含量的測定:采用考馬斯亮藍法測定糖蛋白中的蛋白的含量。糖蛋白純度鑒定糖蛋白是大分子化合物，其純度標準不能用通常的小分子化合物純度標準來衡量，因為即便是糖蛋白純品，在微觀上也是不均一的。糖蛋白的純度只代表某一糖蛋白相似鏈長的平均分布，糖蛋白的純品實際上是指一定分子質量范圍內的糖蛋白均一組分。糖蛋白純度鑒定常用的方法有凝膠層析法、親和層析法、高效液相色譜法、高壓電泳法、超速離心法、旋光法和毛細管電泳法等。凝膠柱層析法準確度較高，易于操作，是糖蛋白純度鑒定中最常用的方法，若糖蛋白經凝膠層析得到單一對稱洗脫峰，則證明該糖蛋白是均一組分。用于糖蛋白純度鑒定的電泳方法有聚丙烯酰胺凝膠電泳、玻璃纖維紙電泳和醋酸纖維膜電泳等，若電泳后顯色，糖和蛋白質的電泳圖譜重合，呈單一色斑，則糖蛋白為均一組分。純度檢查一般要求應用兩種以上方法鑒定，結果才能肯定。有報道，研究者采用葡聚糖凝膠SephadexG-75柱層析處理，分別測定山藥糖蛋白的蛋白峰和糖峰，結果顯示核酸蛋白儀檢測和苯酚一硫酸法檢測結果均為單一洗脫峰，且峰形對應，表明山藥糖蛋白組分均一［10］；將分離得到的短裙竹蓀菌絲體糖蛋白進行醋酸纖維膜電泳，分別用阿利新蘭和考馬斯亮蘭染色，結果兩者均顯示單一斑帶，且兩者泳動距離相近；再將同樣的菌絲體糖蛋白純品經SephadexG-200柱層析處理，分別測定蛋白峰和糖峰，結果顯示蛋白質和糖的吸收峰分別只有一個，且吸收峰位置重合，峰形對稱。兩種方法測定結果表明該糖蛋白為均一物質［11］;采用SDS電泳對山藥糖蛋白純品進行了分子質量的測定，電泳的結果只出現唯一的染色帶，表明所得的山藥糖蛋白已得到純化［4］。糖蛋白的活性表征6.1抗氧化活性自由基產生于人體生命活動的各種代謝反應，可加快機體的衰老，與一些疾病的發生、發展有密切關系。近年來，許多學者通過對天然動植物提取的糖蛋白的研究，發現多種糖蛋白可有效去除自由基，具有抗氧化活性。舒媛［12］等通過對未除蛋白質、Sevag法、蛋白酶法去除蛋白質后的3種山藥粗多糖。繼而測定其還原能力、清除過氧化氫能力、超氧陰離子自由基能力、羥自由基能力，均證實了3種山藥粗多糖均具有抗氧化效果;羅秋水［9］等采用超氧陰離子自由基(OH)、羥基自由基(?OH)、1,1-二苯基-2-苯肼自由基(DPPH?)清除率測定法及還原力測定法評價紫紅薯糖蛋白抗氧化活性，結果表明：在0-640ug/mL濃度范圍內，均具有明顯的抗氧化活性，隨著質量濃度的增加活性增強;其中在紫紅薯糖蛋白的質量濃度為640ug/mL時，對超氧陰離子自由基清除作用達到69.80%；對羥基自由基(?OH)的清除作用達到73.29％。6.2降血脂活性高血脂癥是指血液中的一種或多種脂質成分的含量異常增高的癥狀，大量研究表明，糖蛋白有很好的降血脂的功效。于秋英［13］等對模擬高脂血癥的小鼠，灌胃給以莼菜多糖蛋白體，結果發現它有降低血清膽固醇、甘油三酯、動脈粥樣硬化指數、低密度脂蛋白及升高高密度脂蛋白的作用。李亞娜［14］等人從甘薯中分離得到一種甘薯糖蛋白，其具有顯著降低高血脂癥大鼠中血清膽固醇(TC)和甘油三脂(TG)的含量，尤其是血清膽固醇的含量P<0.01)，甘薯糖蛋白降低血清膽固醇的效應，主要表現在升高升高高密度脂蛋白，降低低密度脂蛋白的作用，并且對肝臟膽固醇含量的升高也具有明顯的抑制作用。抗腫瘤和免疫生物活性目前使用的抗腫瘤藥物會一定程度損害人體的正常細胞、造成機體免疫功能衰退。取自天然原料的糖蛋白對細胞沒有毒害作用，對于提高免疫活性和抗腫瘤的研究具有重大意義。詹玲［15］等通過大豆糖蛋白對小鼠免疫器官的影響的試驗證實其對小鼠的免疫器官沒有顯著的影響。繼而通過小鼠的碳粒廓清實驗證實其能顯著地提高小鼠的中性粒細胞和巨噬細胞的吞噬能力，即提高了小鼠的非特異性免疫功能活性。而經過大豆糖蛋白對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響試驗證實只有高劑量的大豆糖蛋白才能提高小鼠的特異性免疫。錢建亞［16］經過Ames實驗證實甘薯糖蛋白有明顯的抑制疊氮鈉致回復突變的能力，且抗突變作用隨劑量的增大而加強。其又通過體外抗腫瘤試驗證實甘薯糖蛋白能明顯抑制腫瘤細胞的增殖而對正常的細胞并沒有影響。展望糖蛋白具有多種生理功能，在藥學、生物化學、生物工程學及食品科學等領域逐漸受到重視，人們對其生理活性和應用價值也有了更深一步的認識。隨著醫藥學、糖生物學、現代分離純化技術和鑒定技術的發展，糖蛋白的結構與功能之間及糖蛋白與疾病之間的關系及機制研究也將進一步深入。參考文獻：［1］曲有樂，崔宇鵬張宇等.藤壺糖蛋白的提取純化及理化性質分析［J］.醫藥前沿,2012,(32):12.⑵曹妍.燕窩品質分析及印尼白燕盞糖蛋白的分離純化與結構特性研究［D］?中國海洋大,2012.DOI:10.7666/d.y2158045.⑶李敏，高麗，岳曉華等?黃芪糖蛋白的分離純化及其理化性質、組成成分分析[J].中國實驗方劑學雜志,2014,20(13):48-51.DOI:10.13422/ki.syfjx.2014130048.[4]邵海,龔鋼明,管世敏等.山藥糖蛋白的提取及純化研究[J].天然產物研究與開發,2010,22(2):261-263.D0I:10.3969/j.issn.1001-6880.2010.02.021.⑸胡杏麗?黃芪糖蛋白的分離純化、結構分析及免疫活性的研究[D].山西大學,2013.⑹?紫芝胞外