分光光度法測定微藻生物量的研究

微藻的理論研究和生產實踐通常需要知道微藻的正確生物量。然而，由于個體規模小、裸眼少、數量大、微藻生物量準確測定難、費時、費時的問題之一。近年來，光譜學方法取得了良好的前景。其中，光譜法具有簡單快速的特點，廣泛用于測定各種物質和生物量的測定。波長的選擇是分光光度法測量過程中最關鍵的因素.對一些綠藻藻體用200~800nm的吸收光譜掃描,藻類吸收峰的分布可分為3個波段區:200~400nm的紫外光區,400~600nm的藍光區和600~800nm的紅光區.紫外光區的吸收峰主要是在290nm附近出現,峰值特別高,主要由藻體中的蛋白質引起.由于藻蛋白因藻類生長時間的不同變化很大,故一般不采用該波長用于藻類生物量的測量;藍光區的吸收峰較多,有葉綠素、類胡卜素等色素的吸收峰,同時也是比濁法的檢測波長范圍(450~600nm).由于此區間各色素吸收峰相距較近,容易相互干擾或常交叉重疊,有時甚至不能得到明顯的吸收峰,因此這一波長區間對藻胞液進行的比濁法或者色素測量獲得的數據不能排除其它非微藻粒子的影響以及微藻形狀差異、細胞色素差異引入的誤差,精確度顯然會受到影響;600~800nm主要是葉綠素的紅區吸收范圍,其中葉綠素a在670~680nm有顯著地吸收峰,葉綠素b在650nm有一吸收肩峰.選取600~800nm的波長作為光譜掃描范圍,理論上克服了其它波段測量結果精準性的不足.為此,本試驗以6個微小綠藻為試材,開展血球計數板顯微計數法與紅光區色素吸收峰法的比較研究,探尋、驗證二種方法間可能存在著的正向偶聯關系,為分光光度法快速、簡便、準確的確定純種微小綠藻生物量提供理論支撐.1材料和方法1.1聚合物藻的種類以從重慶市縉云山黛湖中分離純化的6株綠藻為試材:四尾柵藻(Scenedesmusquadricanda)、卷曲纖維藻(Ankistrodesmusconvolutus)、普通小球藻(Chlorellavulgaris)、蹄形藻(Kirchneriellasp.)、橢圓小球藻(Chlorellaellipsoidea)、針形纖維藻(Ankistrodesmusacicularis),分別編號為m1-m6.1.2測試方法1.2.1藻細胞密度測定使用實驗室保藏的純化藻種接種到100mLBBM液體培養基中,27℃,光照強度4000lx,光暗比1∶1,培養約兩周.藻液5000r/min離心15min,棄去上清液,藻泥加一定量蒸餾水,重懸,使最終藻細胞密度達到106~107個/mL,備用.1.2.2測定波長的確定使用紫外可見分光光度計(UV-1000,上海天美),以蒸餾水為空白.選擇600~800nm波長范圍,對樣品進行波長掃描,以最大吸收峰對應的波長為測定波長.使用備用的藻液和蒸餾水,按照0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0(藻液mL/總體積mL)分別配制6個濃度的藻液各3mL,混勻后以濃度為0的藻液為空白,測定溶液OD,每個樣做3個平行.1.2.3藻藻粒子濃度使用血球計數板對分光光度法中配制的藻液進行顯微計數.記錄右上、右下、左下、左上、中間5個中號方塊中的單胞藻或藻胞群體數目,記為a1,a2,a3,a4,a5.微藻粒子濃度計算公式為:1.2.4在數值差分法中，顯微鏡法的線性適應分析將上述分光光度法測得的數據與顯微計數獲得的數據分別繪制成散點圖,分析其線性擬合情況.1.2.5測試測試1.2.5.微藻粒子的檢測將保存在BBM平板培養基上的6株藻胞群分別取一接種環至1mL無菌水中,稀釋均勻后,分別取300μL接種到150mLBBM液體培養基中,每個藻株3個平行.27℃,光照4000lx,光暗比12∶12(hrs/hrs),每日搖動3次.從培養的第6d起至第25d(共20d),每日取3mL培養液650~700nm掃描其吸收峰,并對該藻液立即進行顯微計數.以OD685為橫坐標、微藻粒子濃度D(個/mL)為縱坐標,觀察線性擬合情況.1.2.5.測定總體積ml的od上述接種和培養方法將6株綠藻培養20d,藻液和蒸餾水按照0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0(藻液mL/總體積mL)分別配制6個濃度的藻液各3mL,混勻后以濃度為0的藻液為空白,測定溶液OD,每個樣做3個平行.1.2.6處理數據圖表制作及數據處理使用Excel2007.2結果與分析2.16葉綠素a的紅區吸收峰對實驗室已經純化培養的6株綠藻按照表1設計要求配置成標準濃度藻胞液后,各自進行波長掃描,分別觀察這6株藻胞液的最大吸收峰.結果如圖1所示,所有供試綠藻的最大吸收峰均在685nm出現,為葉綠素a的紅區吸收峰,與大多數報道的670~680nm的吸收峰略微紅移;650nm有一肩峰為葉綠素b的紅區吸收峰,與大多數報道一致.由于650nm處的肩峰不易識別,685nm處波峰顯著,易于識別,因此,685nm波長是紅區最適宜的比色波長,后續試驗都選用這個波長開展研究.2.26藻液擴增后od值的測定按濃度梯度稀釋后,以稀釋度為橫坐標,OD685為縱坐標,繪制標準曲線,進行線性擬合,獲得6株微藻的標準曲線,6條曲線幾乎都是直線,只是斜率有差異而已(圖2A).它們的R2值高于0.993,表明這6株藻在685nm波長下測定出的OD與藻液稀釋度有著良好的線性關系.所以685nm波長為發射波長測定的OD值能夠較為準確地反映出藻液生物量的變化.2.3顯微計數的標準曲線使用血球計數板顯微計數方法對配制藻胞液的微藻粒子密度進行測量,以稀釋度為橫坐標,微藻粒子密度為縱坐標,獲得6株微藻顯微計數的標準曲線如圖2B所示.顯微計數標準曲線的R2=0.928~0.992,且它們的誤差線大多長于分光光度法標準曲線.所以總體而言顯微計數的精度和穩定性小于分光光度法.2.4藻液生物量的測量在實際應用中常常用顯微計數的方法確定藻胞密度和表達培養液中藻細胞的生物量,然而,顯微計數在樣本數量巨大時,測量既費工又費時.因此期望用更經濟有效的方法進行生物量測量.從圖2的A和B可以看出,相同微藻粒子稀釋度的顯微計數擬合直線與OD685值的擬合直線的斜率非常接近,它們之間應可能存在正向的線性擬合關系.于是,以配制藻液OD685值為橫坐標,顯微計數所得微藻粒子濃度為縱坐標,在圖2C中做線性偶聯擬合,擬合結果與預期十分吻合,二者間的R2值高于0.900,顯著線性正相關.結果表明,微藻粒子的OD685值能夠反映藻液中的藻胞密度或生物量.2.5od685值與微觀計數的線性適應試驗2.5.1熒光區最大吸收峰與od655值的擬合分析上述試驗是基于同一時間、相同生理狀態、不同密度的藻胞為試材進行的試驗,盡管微藻粒子密度與OD685值顯著線性正偶聯,但是,這種正偶聯現象是否能在微藻粒子培養過程中重復出現,仍然需要作進一步的試驗研究.為了驗證藻胞在培養生長過程中紅光區的最大光譜吸收峰是否仍在685nm處,OD685值與微藻密度是否也線性相關,本試驗以連續培養25d的藻液為測試對象,從培養的第6d開始,每天堅持在同一時間參照前述方法檢測藻液的紅光區最大吸收峰、OD685值以及顯微計數,共測量20d.結果表明:不同培養時間、不同生理狀態的微小綠藻的光譜掃描結果與前述試驗結果一致,均在685nm處有最大吸收峰(圖3),OD685值與顯微計數密度值間的線性擬合結果相關性好,其中4個藻株的R2值高于0.940,2個藻株的R2值在0.780~0.880之間(表1).進一步證明紅光區OD685值能夠用來反映微藻粒子在培養過程中的真實生物量的變化.2.5.2混合藻種的驗證試驗本研究寄希望于尋找通用于微小綠藻生物量測量的方法,自然水域或人工培養過程中水樣常常會包含多種綠藻,因此進行了混合藻種的驗證試驗.所培養的6種綠藻培養到20d時按同樣體積比例混合,配制成濃度梯度,分別測量各濃度梯度下的OD685和總藻胞濃度.結果顯示其R2=0.972(表1),顯示出較好的線性相關度,證明了使用OD685計數可以相對準確地反映出混合藻液中的微小綠藻的細胞數目.3討論3.1吸收光譜特征文獻中使用的波長因藻種不同而有較大的差異,即使是同一藻種也不盡相同.如:崔妍等測量原殼小球藻使用440nm;HuesemannM等測量5株海水綠藻生物量使用570nm;左明等測量小球藻生物量使用640nm.圖1和圖3證明了這6株綠藻600~800nm的最大吸收峰始終在685nm.680nm附近是葉綠素a的紅區吸收峰,綠藻中的葉綠素含量相較其他藻類多,故而其吸收峰比較大.在驗證試驗中,6個藻株的20d定時連續光譜掃描圖上,高度一致地在685nm處有最大吸收峰(圖3).這些研究結果充分證明:使用685nm波長作為發射波測定6株微藻粒子生物量的變化具有良好的精確度,能夠準確反映出培養液中藻細胞生物量的變化.另外,供試藻株分別隸屬于綠藻4個不同的屬,形態上有單胞藻(小球藻)也有群體(柵藻、蹄形藻)藻,有球形的(小球藻)也有細長的(纖維藻),有膠質鞘的(蹄形藻)也無膠質鞘(柵藻、小球藻等),有較細小的(纖維藻)也有相對較大的(小球藻、柵藻),這些微藻粒子形態基本上代表了微小綠藻的體態,形態上的巨大差異并不影響它們在685nm處都具有最大的吸收峰的特征.因此,筆者認為:685nm處的OD值是準確反映微小綠藻生物量變化的特征值,685nm處的吸收峰是微小綠藻特征吸收峰.3.2顯微計數的擬合結果目前藻類生物量的測定方法多很,但主要分為兩大類,一種是直接測定藻細胞數目或質量等物理參數來表示生物量,如:干重法、比濁法、顯微計數法、細胞體積計算法等;另一種是測定藻細胞中的理化指標來表示生物量,如:測定葉綠素含量、ATP含量、TOC等.從經濟、簡便、快速的角度來看,直接測量藻液OD和顯微計數是相對優良的方法,但這兩種方法從上述試驗結果看來精確度不完全一樣.圖2B反映稀釋藻液的顯微計數擬合結果的R2在0.920~0.990均有分布.由于藻體大小、形狀、群體組合、繁殖方式、計數者計數習慣等因素的不同,會帶來較大的誤差.例如纖維藻類比較長,位于計數區域邊界上的藻細胞是否計入結果、分裂后尚未完全分開的多細胞群體是否計為多個細胞等因素受計數者本身判斷會帶來一定誤差.如:蔡卓平等對3株微藻(三角褐指藻、亞心形扁藻、海洋小球藻)進行計數,其擬合曲線R2>0.990;而李士虎等對小新月菱形藻計數其擬合曲線為0.885.對比分光光度法和顯微計數法的誤差線,前者的波動性明顯小于后者.可見由于不同藻種形態上的巨大差異和計數者的不同,顯微計數的結果有一定的差異;藻胞群體的發育情況也直接制約了以細胞數目表示整體生物量的準確度.3.3藻體光度法結果純種驗證試驗中,6株綠藻培養了25d,前5d的藻培養液吸收峰幾乎沒有多大的變化,從第6d開始,出現顯著的最大吸收峰.此后每天定時波長掃描檢測,結果發現,在不同培養時間內,6株綠藻的最大吸收峰波長未發生改變,仍在685nm處,與前面用配制藻液進行的光譜測量結果一致,表明685nm處的吸收峰就是微小綠藻的特征吸收峰(圖3).將6株藻的純種驗證試驗OD685計數和配制藻液的顯微計數、OD685計數的擬合曲線R2數值進行對比,分別計算每種藻上述3項擬合曲線的R2的標準差σ.四尾柵藻(σm1=0.015)、卷曲纖維藻(σm2=0.014)、小球藻(σm3=0.001)、橢圓小球藻(σm5=0.008)4個藻株的相對標準差低于2%,具有很高的精確性和方法穩定性,其中四尾柵藻(R2≥0.950)、小球藻(R2≥0.940)、橢圓小球藻(R2≥0.970)3株藻分光光度法結果與顯微計數的測量結果幾乎一致,精度高.而蹄形藻(σm4=0.060)、針形纖維藻(σm6=0.116)的相對標準差分別為6.3%,12.7%,出現了較大的偏移.分析主要有兩個原因:其一,顯微計數法本身的精度受限制.因為針形纖維藻很細長,進入觀察視野框線上的藻胞因體態和位置的原因不一定被計入統計范圍,也就是說如果觀察視野框上這樣的藻胞多的話,以顯微計數為基礎制定的標準曲線與真實數據間會產生較大的誤差;其二,由藻種本身的生長特性與計數方法所致誤差.從圖3可明顯發現,培養相同的時間,針形纖維藻藻液OD遠低于其他藻種.因為溶液中粒子濃度越低,使用取樣統計再進行換算求總量的方法誤差將越大.而分光光度法則是測量容積中所有的葉綠素a,沒有信息丟失,與真實數據間沒有誤差或誤差小得多.混合藻