雙向電泳技術的研究進展

2001年2月15日，全球人類共同事件序列的完成意味著人類將進入后半部分的基本組時代。基因組時代的研究發現,在揭示基因組精細結構的同時,也顯示出基因數量的有限性和基因結構的相對穩定性,這與生命現象的復雜性與多變性之間存在著巨大反差。這種反差的存在使人們認識到,要研究生命現象,僅僅研究基因組的結構是遠遠不夠的,必須對生命活動的直接執行者-蛋白質的重要性有更深刻的了解,因此,一個以“蛋白質組”為研究重點的時代已悄然到來。“蛋白質組”一詞的英文是PROTEOME,由PROTEins和genOME兩個詞組合而成,這一概念是由澳大利亞Macquarie大學的Wilkins和Williams在1994年提出的,是指基因組表達的全部蛋白質,廣義上講,蛋白質組是指“一個細胞或一個組織基因組所表達的全部蛋白質”。作為研究蛋白質組的三大核心技術之一,(另外兩種分別是計算機圖像分析與大規模數據處理技術以及質譜技術)。雙向電泳(two-dimensionalelectrophoresis,2-DE)是目前唯一可將數千種蛋白質同時分離的方法,雙向電泳技術聯合質譜鑒定技術被公認為是目前蛋白質組研究技術的標準方法本文擬就雙向電泳技術各個步驟的最新進展做一綜述。1elp技術原理雙向電泳,又稱作雙向凝膠電泳(two-dimensionalgelelectrophoresis),由O′FarrelPH最早建立于20世紀70年代。該技術用于蛋白質的分離,其操作步驟分為兩步,第一步稱作等電聚焦(isoelectricfocusing,IEF),這一步的原理是將蛋白質根據pH梯度分離至各自等電點,通過電荷來分離蛋白質;第二步是十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)第二次分離是根據蛋白質分子量大小的不同將其在與第一向垂直或水平方向上分離。2蛋白質抽提過種的制備方法如何從細胞組織中盡可能完整地,并且盡可能多的將蛋白質以溶解狀態提取出來,是蛋白質組研究的首要步驟。樣品制備最基本的三個步驟是,組織或細胞的破碎,失活或者去除干擾物質,蛋白質增溶溶解。由于蛋白質不能溶化也不能蒸發,其所能分配的物相僅限于固相和液相,并在這兩相間交替進行分離純化。因此在制備樣品的過程中,就只能利用蛋白質在此兩相中分配率的不同來提取。在蛋白質抽提過種中,有幾條共同的原則需要遵循:一是盡可能多溶解全部蛋白質,打斷蛋白質之間的非共價鍵結合,使樣品中的蛋白質以分離的多肽鏈形式存在;二是避免蛋白質的修飾作用和蛋白質的降解作用;三是避免脂類、核酸、鹽等物質的干擾作用;四是蛋白質樣品與第一向電泳的相容性。2.1細胞或組織的破裂細胞破碎主要采用機械,物理和化學的方法進行。由于細胞在破碎時會釋放出蛋白酶,因此加蛋白酶抑制劑。常用的細胞破碎方法有如下3種。2.1.1高速轉動的嫌犯刀主要通過機械切力作用使組織細胞破壞。常用器械有:①高速組織搗碎機(轉速可達10000r/min,具有高速轉動的鋒利的刀片),尤其適用于動物內臟組織的破碎;②玻璃勻漿器,用兩個磨砂面相互磨擦,將細胞磨碎,適用于少量材料,也可用不銹鋼或硬質塑料等,兩面間隔只有十分之幾毫米,對細胞破碎程度較高速搗碎機高,機械切力對分子破壞較小。2.1.2樣品的預處理主要通過各種物理因素的作用,使組織細胞破碎。常用的方法有:①反復凍融法:現在使用的方法主要是將樣品在液氮中凍結后,迅速融解,再凍結,再融解,如此循環多次,由于滲透壓的變化,使結合水凍結產生組織的變性,冰片將細胞膜破碎,使蛋白質可融化,成為粘稠的濃溶液。以前也有將樣品在冷藏庫或干冰中反復凍融的;②超聲波法:屬于較強烈的破碎方法,因為超聲過程中會產熱,所以要求在冰浴上進行,間歇處理,不同的樣品選擇不同的功率;③研磨法:將樣品加入瓷缽中,然后加液氮研磨成粉末。上述3種方法是物理方法中最基礎的,其余的方法均是在此3種方法上的衍變,其最基本的原理是一樣的。2.1.3液體輔助破碎細胞化學方法使用較少,主要是加入一些化學物質,利用化學反應達到分離蛋白的作用。常用的方法包括:①有機溶媒法,多在0℃以下加入5~10倍量的丙酮,迅速攪拌均勻,可以破壞細胞膜,也可以破壞蛋白質與脂質的結合;②自融法,將待破碎的新鮮材料在一定的pH和溫度下,利用自身的蛋白酶將細胞破壞,使細胞內含物釋放出來;③酶法,用一些蛋白酶除去變性的蛋白質。與機械方法和物理方法相比,化學方法使用較少。2.1.4蛋白酶抑制劑①為避免因為蛋白質變性后在最后的圖像上引起偽點和大分子量蛋白的丟失,應該使用蛋白酶抑制劑;②鹽離子會干擾電泳分離的過程,如果它們的濃度太高,大于100mmol/L就應該去除;③多糖和核酸可以與載體兩性電解質以及蛋白質發生作用,并且會在2-D膠上引起條紋,所以要去除。2.2溶解過程控制經過細胞破碎及干擾物質的去除之后,個別的多肽要通過變性和還原來破壞分子內或分子之間的相互作用,而且在溶解過程中還要保持內在電荷的特性。樣品溶解經常是在緩沖液(又稱裂解液)中進行,無論裂解液組成如何變化,其各個組份都應該包含最基本的3種物質,分別是離液劑(又稱促溶劑),去垢劑(又稱表面活性劑)和還原劑。這3種物質在樣品裂解液中的作用是無法使用其他物質來替代的。2.2.1離液劑的種類離液劑的作用是來破壞氫鍵等次級鍵的結構,使蛋白的肽鏈伸展開來,充分暴露疏水中心,降低接近疏水殘基的能量域。目前最常使用的離液劑是硫脲(thiourea),由Rabilloud首先介紹,硫脲非常適合用來打斷氫鍵之間的疏水作用,但是硫脲的不足之處在于其在水溶液中溶解性太差,因此限制了它的單獨使用。但是硫脲在一定濃度的脲溶液中溶解性增強,目前,最好的解決方法就是將此二者聯用,5~7mol/L脲與2mol/L硫脲與合適的去垢劑聯用,可以增強蛋白溶解的效果。2.2.2非離子或兩性離子去垢劑去垢劑的作用在于破壞蛋白質分子之間的疏水相互作用。最常使用的去垢劑包括陰離子去垢劑SDS,非離子去垢劑TritonX-100和NP-40,兩性離子去垢劑CHAPS等。陰離子去垢劑SDS是最有效的表面活性劑之一,有人建議在沸騰的SDS溶液中進行蛋白溶解。如果樣品在1%的SDS溶液中溶解而沒有在至少4倍的(脲或硫脲)裂解液中稀釋,使用非離子或兩性離子去垢劑來代替陰離子去垢劑SDS,使其的濃度降在0.2%以下,就會在2-D圖像中觀察到水平的條紋。因為2-DE上樣量的嚴格要求與為獲得SDS的足夠稀釋之間的矛盾,現在越來越多的使用非離子去垢劑和兩性離子去垢劑。最常使用的陰離子去垢劑是NP-40,TritonX-100和十二烷基麥芽苷。不足之外是TritonX-100和NP-40在溶解疏水性極強的膜蛋白不是十分有效。與之對比,兩性離子去垢劑如CHAPS,硫代甜菜堿在溶解膜蛋白方面作用更強。更精細的研究揭示,兩性離子去垢劑在溶解疏水性蛋白的有效性方面的原因,不僅是由于蛋白質本身的特性,而且還在于一些其它物質的特性,特別是樣品中的脂質物。即便取得了很大的進步,研究表明,不存在任何一種單一溶液能解決復雜的蛋白溶解問題。多數膜蛋白不能在單一的非離子去垢劑或兩性離子去垢劑完全溶解,改善裂解液的配方,來提高膜蛋白的溶解度,仍然是非常重要的工作。2.2.3硫代赤蘚醇還原和防止二硫鍵的再次氧化也是樣品制備的一個關鍵步驟。還原劑在清除分子間或分子內二硫鍵的相互作用,維持蛋白分子保持斷裂方面起重要作用。最常使用的還原劑是二硫蘇糖醇(DTT)或者二硫代赤蘚醇(DTE),這兩種還原劑的用量都較大,濃度要高于100mmol/L。DTT本身還帶有電荷,在等電聚焦時,常常會遷移到pH范圍以外,從而使某些二硫鍵重新配對,使溶解度降低而重新沉淀下來。Herbert等人最先建議使用非離子型還原劑三丁基磷(tributyl-phosphine,TBP)來替代DTT和DTE。因為TBP化學反應的原因,其應用濃度非常低,僅2mmol/L,而且可以大大增加蛋白質的溶解性,并可幫助蛋白質從第一向轉移到第二向。TBP的不足之處在于其在水溶液中的溶解度太差以及半衰期過短。2.2.4分步提取法:提取和細胞對于細胞的表達,是根據克對全細胞蛋白質進行預分離(pre-fractionation)是提高低豐度蛋白質和膜蛋白檢出限的有效方法。一種是被稱為分步提取法,其原理是基于蛋白質的溶解度不同,采用3種不同的提取液對全細胞蛋白質進行分步提取和分別電泳。還有一種預分離的方法稱為多間隔電解法,此種方法實質上是一種制備等電聚焦的方法。3固相ph梯度法分離金屬離子蛋白質組研究的先決條件也是最大的挑戰就在于從復雜的生物樣品中將蛋白質分離出來,并且要求有很高的重復率和分辨率。O′Farrell′s最先發明的載體兩性電解質(carrierampholyte,CA)雙向凝膠電泳技術成為了世界范圍分離復雜樣品蛋白質的標準方法,但是,該方法即使在同一個實驗室也很難獲得重復的結果,更不用說不同實驗室之間的結果比較。重復性差的原因主要在于合成的CA,比如梯度不穩定,聚焦時間過長,陰極漂流,不同時間制備的CA之間的變異等等。在實際應用中,由CA產生的pH梯度很少能超過pH7.5,其結果將是堿性蛋白的丟失。真正的一向等電聚焦技術的突破是在Immobilines試劑的基礎上開發的固相pH梯度(immobilizedpHgradient,IPG)技術。IPG技術在很大程度上解決了重復性差的問題。3.1解決酸性及堿性蛋白檢出率的問題第一向等電聚焦是根據蛋白質等電點的不同將其分離,為提高分辨率和蛋白質的檢出率,必須不斷改進膠條。一方面是膠條的pH范圍,在不斷變窄的同時也在不斷的擴大。目前相差一個pH范圍的窄膠條及pH3~12的膠條均已有商品化,這些膠條的出現,極大的改善了酸性及堿性蛋白的檢出率。另外一方面是膠條長度的改變,目前有7cm,11cm,13cm,18cm及24cm,18cm有膠條是目前最常用的一向IEF膠條。有報道稱,使用更長的膠條可以增加蛋白質的分辨率和檢出率。上樣量根據考染或銀染及實驗目的不同而不同,一般來說考染要求的上樣量較大。理論計算,2-D圖譜上將會有30%的堿性蛋白其等電點在pH12以上。對于極堿性蛋白的分離,寬pH范圍,如3~12或是4~12的IPG膠條更適合。在第二向分離之前需要進行平衡,平衡的目的是通過平衡液中的DTT或β-巰基乙醇使蛋白質分子中的二硫鍵保持還原狀態,有利于SDS與蛋白質的充分結合。3.2凝膠的分離和石鏡的制備SDS可以在水平或垂直兩個方向進行。水平膠可利用預制膠在自制平板膠運行,水平膠的優點是凝膠附著在塑料支持膜上,在染色過程中可以防止凝膠大小發生變化,水平膠分離蛋白的邊緣要比垂直膠清晰,此外,蛋白質點的分布變形程度小。水平膠不能同時運行兩塊膠,所以,為了同時運行獲得圖譜的重復性,就要用垂直電泳。較之一向等電聚焦的變化來說,二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳自從問世以來,其變化不大。4蛋白質鑒定法二維電泳后分離得的蛋白質常規檢測和定量的普遍方法是考馬斯亮藍染色和銀染。這兩種染色方法相比,考染法具有染色過程簡單,所需配制試劑少,操作簡便,無毒性,染色后的背景及對比度良好,與下游的蛋白質鑒定技術相容等優點,但是其不足之處在于靈敏度低,檢測蛋白的極限是8~10ng,對于低豐度蛋白難以顯色。銀染法的特點相對于考染法來說,優點是靈敏度高,可達200pg,但其不足之處在于操作過程煩瑣,而且染色過程中醛類的特異反應,使得對凝膠酶切肽譜提取存在困難,進行質譜鑒定之前增加了脫銀的步驟。隨著質譜鑒定靈敏度的不斷提高,考染和銀染法用于蛋白質組研究中的局限性逐漸暴露出來,新的染色方法,如熒光染色,同位素標記,負染法等等不斷出現,新方法的出現,都是從兩個方面在改進,第一,提高蛋白檢測的靈敏度,第二,增加與下游質譜鑒定的兼容性。5蛋白分離和活性發展雙向凝膠電泳技術在目前仍然是蛋白質組研究不可替代的分離方法,有很