大白菜前pancorl合子發育的透射電鏡觀察

卡車前（計劃財務部m.）是車輛的前科植物。大車前與車前、平車前合稱為車前子,為傳統中藥。有關大車前的研究工作多在化學成分、藥理、藥性及臨床應用等方面(Oshio&Inouye,1982;Todaetal.,1985;Ravnetal.,1990;Miyaseetal.,1991;Tomodaetal.,1991;Nishibeetal.,1995;Samuelsenetal.,1995),而其植物胚胎學方面的研究很少。Johri等(1992)在《被子植物比較胚胎學》一書中對車前科車前屬胚胎學特征做過簡略的介紹。超微結構研究方面,只見過胚貯藏的蛋白體、卵器和成熟胚囊超微結構研究的報道(Vannereau,1978,1980;Shoar-Ghafari&Vintejoux,2003)。本研究室在光鏡水平上對大車前的胚及胚乳發育進行了較為系統的研究(申家恒等,2010)。本研究重點為合子以及原胚發育的超微結構特點,為進一步闡明大車前的生殖結構特征,確立車前科的分類學地位提供依據。1房剝離胚片的制備大車前種植于哈爾濱師范大學植物園內。2007—2009年,每年6月中旬至7月中旬每天上午8:00和下午4:00取材,取花期及花后子房剝離胚珠進行固定。室溫下用3%戊二醛(0.2mol·L-1二甲胂酸鈉緩沖液配制)固定2~3h,緩沖液沖洗后,再用1%的鋨酸(0.1mol·L-1的二鉀胂酸鈉緩沖液配制)固定4h。緩沖液沖洗后,乙醇系列脫水。Spurr環氧樹脂滲透和包埋。LeicaUltracutR型超薄切片機切片,切片厚度70nm,醋酸雙氧鈾及檸檬酸鉛染色。JEM-1230型透射電鏡觀察照相。2體細胞衍生細胞大車前胚胎發育類型為柳葉菜型,合子分裂形成頂細胞與基細胞,頂細胞分裂發育成胚體,基細胞只進行橫分裂發育成胚柄,基細胞的衍生細胞不參與胚體的構成。2.1粗面質網及細胞器卵細胞受精后形成合子,合子發育最顯著特征是細胞壁的構建、體積變化以及極性的加強。發育早期的合子(圖1,1、2)具有極性,細胞核位于合點端,核內有異染色質;中部液泡較大,合點端液泡較小,合點端的細胞壁尚未形成,與中央細胞之間的質膜間隙大小不一,有的形成較大空隙,有的兩質膜緊密貼合;細胞質主要集中核周區,大量線粒體內嵴明顯;質體形態多樣,不含淀粉粒;粗面內質網呈短管狀;液泡為自體吞噬泡,內含有電子致密物質;沒有發現高爾基體。合子發育中期體積縮小,細胞核位于近合點端,核仁增大有液泡,核內分布異染色質,小液泡較少,其內含電子濃密物質(圖1,3),細胞質濃密,分散著大量線粒體、質體與粗面內質網。珠孔端的細胞壁明顯,合點端的質膜附近有高爾基體分布,活躍的分泌小泡,參與細胞壁的建成(圖1,4),最初形成的合點端細胞壁呈蜂窩狀,隨后蜂窩狀的細胞壁逐漸連接形成完整的細胞壁,將合子包圍(圖1,3、5)。隨后,合子體積伸長,細胞質里出現較多的小液泡(圖1,5)。細胞核位于近合點端,細胞核大,核仁明顯、存在核液泡;細胞器繞核分布,質體形態多樣,富含淀粉粒;線粒體多為圓球形,內嵴明顯;內質網、高爾基體數量增多(圖1,6、7)。合子極性加強(圖1,5)。合子分裂前期,合子縱向延伸,體積達到最大。小液泡融合成大液泡位于珠孔端,細胞核位于合點端(圖1,8)。細胞壁完整,珠孔端的壁略厚于合點端。細胞質中細胞器的含量明顯增多,分布于細胞核及液泡的周圍,最顯著的是質體,不但數量多,而且含淀粉粒(圖1,9)。表明合子分裂前期其代謝活動活躍。2.2原生動物發育的超微結構特征2.2.1頂細胞細胞間的胞間連絲胚的發育是從合子分裂開始,歷經原胚期、心形胚、魚雷胚與子葉胚,最后達到種子成熟。本研究主要集中于原胚階段超微結構特征,人為劃分4個階段,即二細胞原胚時期、小球胚時期、中球胚時期和大球胚時期。合子的極性決定了合子分裂方向以及胞質分割不均等。合子的橫分裂使基細胞體積明顯大于頂細胞,胞質集中在頂細胞內,頂細胞比基細胞的電子密度高(圖1,10)。頂細胞與基細胞間的細胞壁上存在胞間連絲(圖1,11),細胞之間存在大量的質膜內陷(圖1,12)。二細胞之間的差異預示頂細胞將發育為胚體,而基細胞將發育為胚柄。頂細胞細胞質中的核糖體數量增加,導致其電子密度提高(圖1,10),細胞核、核仁大且明顯,核仁內有一大的核液泡,核膜不規則且不清晰。線粒體數量多,內嵴顯著;質體數量較少;核膜周圍分布一些管狀內質網以及一些小液泡,液泡膜不清晰,液泡內含有電子密度高的物質(圖2,1)。基細胞細胞質中核糖體數量較少,導致其電子密度降低,細胞核與核仁大,核膜規則,核仁內含有液泡,核內存在異染色質。線粒體內嵴明顯,部分線粒體外膜不清晰;管狀內質網分布于細胞質里;高爾基體大量分布,旺盛分泌小泡(圖2,2、3);基細胞珠孔端存在許多小液泡(圖2,2)。頂細胞與基細胞間的細胞壁上存在胞間連絲(圖1,11),并存在大量的質膜內陷,其內有分泌小泡的存在(圖1,12)。二細胞原胚與周圍的胚乳細胞交界處分布著染色深的黑色嗜鋨顆粒(圖1,10;圖2,4)。二細胞原胚發育后期,基細胞和頂細胞的液泡進一步融合、擴大,致使原胚體積縱向延伸(圖2,4)。2.2.2胚柄細胞形態和內部質網特征胚體從8細胞向16細胞胚體發育,胚柄為單列4個細胞。胚體細胞的分裂速度快于胚柄(圖2,5)。由于胚體細胞分裂速度快,胚體細胞體積變化不明顯(圖2,6),胚體細胞細胞質電子密度高,細胞核大,染色質較深,核膜規則且清晰,核內含大且不規則的核仁,核仁內有多個小核液泡(圖2,5、6)。線粒體、質體沿核周圍分布,線粒體呈圓球形或棒形,內嵴明顯;質體形態多樣,其內不含淀粉粒。內質網、高爾基體、分泌小液泡分布于沿壁的細胞質內(圖2,7~9)。各細胞間的質膜內陷內含分泌小泡(圖2,8)。小球胚的胚柄細胞數大約4~8個(圖2,5)。胚柄細胞數的增加將胚體推入胚乳本體之中(圖2,5)。胚柄細胞核較大,核膜清晰,核內存在1或2個核仁且具核液泡(圖2,5)。核周圍分布大量的線粒體和質體,質體不含淀粉粒。內質網呈管狀散亂分布,數量少。少量的高爾基體在細胞相接的細胞壁附近出現(圖3,4、8)。此時為小球胚的形成期,其營養物質主要來自合子貯存以及胚柄吸收并轉運的營養物質。2.2.3含淀粉粒的分離和鑒定小球體進一步發育形成中球胚(圖2,10;圖3,1)。胚體細胞分裂速度加快,細胞數量迅速增加、小液泡匯聚,融合成稍大的液泡,細胞核較小,核仁清晰,有小核仁,異染色質和核液泡存在(圖2,10)。細胞器的種類與數量沒有太大變化,質體大量分布,形態多樣,內含淀粉粒;線粒體廣泛分布,內嵴明顯;高爾基體大量存在,旺盛分泌小泡,主要分布于細胞壁附近(圖3,7)。細胞間有質膜內陷,并有分泌泡存在。胚體周圍可見退化的胚乳細胞(圖3,1)。胚體周圍存在嗜鋨顆粒(圖3,7)。胚柄細胞達到8~16個(圖3,1、2)。細胞數不再增加,胚柄最為發達。合點端的胚柄細胞的細胞質濃厚,細胞器的種類與數量與小球胚期并無太大變化。胚柄珠孔端的細胞最大,大液泡占據大部分體積,細胞質和細胞核被擠向合點端,細胞壁厚,質膜內陷,分泌泡多。細胞質里存在顆粒較大的嗜鋨顆粒(圖3,1、2;圖2,10),可能與胚柄通過頂端細胞從珠被組織中吸收營養物質有關。胚柄細胞之間的壁上也存在質膜內陷,有分泌小泡,并有少量胞間連絲存在(圖3,5;圖4,2),胚柄細胞質里有豐富的細胞器(圖3,6)。胚體所需營養主要依賴胚柄自珠被組織吸收并轉運至胚體,供胚體發育。2.2.4體外細胞的誘導退化胚體細胞繼續分裂,不斷增加胚體細胞數量。胚體細胞核仁明顯,含有核液泡并有異染色質(圖4,1、7、8)。細胞質中含有大量線粒體、不含淀粉粒的質體、內質網、大量杯狀高爾基體和分泌小泡(圖4,3~6)。胚體外層細胞均存在質膜內陷(圖4,4、5)。胚體周圍的胚乳細胞解體,細胞降解后的物質凝成電子致密、大小不等的嗜鋨顆粒貼壁分布(圖4,7、8),大球胚后期,胚乳細胞進一步解體,胚體周圍出現含水解物的腔(圖4,7)。胚柄珠孔端細胞先行退化,而后合點端細胞開始退化(圖4,8、9)。細胞器的退化依然按質體先解體,其后依次為線粒體、高爾基體和液泡(圖3,4、9)。胚柄細胞間有質膜內陷(圖3,4),細胞壁與質膜之間以及胚柄細胞間存在一層濃密均勻的物質(圖3,9)。隨著大球胚出現器官分化,胚柄徹底退化,喪失其功能,只能看到胚柄痕跡。3討論3.1大地構造的早期合子型合子的特征合子為卵細胞與精子融合的產物,是新一代孢子體的第一個細胞。概括許多作者有關合子超微結構特征的觀察結果,合子有3個主要特點,其一為體積的變化,其二是合點端細胞壁的修復,其三是極性的加強。這些變化均為合子分裂以及子細胞的分化奠定基礎。大車前合子的超微結構的特征基本符合上述特點。但是需要指出在不同植物里均存在或長或短的“合子靜止期”(Hu,2005)。超微結構研究表明在此時期合子經歷細胞質重組過程,大車前合子形成初期合子核位于合點端,分布于細胞核周圍的細胞器中線粒體、質體數量較多,質體內不含淀粉粒;而合子后期,圍繞在核周圍的各種細胞器的數量增加,而且質體內有明顯的淀粉粒積累。合子極性的加強,預示將決定其分裂方向,質體內淀粉粒的積累將為分裂活動提供能量物質。3.2原胚及球胚期營養主要依賴合子和原胚的貯藏原胚發育的不同階段,營養物質的來源有所不同。推測大車前原胚發育營養物質來源如下。卵細胞受精致使圍繞卵核周圍的質體內的淀粉被消耗;合子前期,核周圍的質體內無淀粉粒,經歷合子靜止期自孢子體吸收營養物質,合子后期質體內重新積累淀粉粒。這在以前的研究中沒有引起重視。以往的研究認為,合子及原胚早期發育所需營養主要依賴卵細胞本身貯藏的營養物質(胡適宜,1964;You&Jensen,1985;張松林和金芝蘭,1994)。本研究結果表明二細胞原胚以及四細胞原胚之前的胚細胞內均可見質體中存在淀粉粒。因此,可以推測,原胚發育初期所需營養主要依賴合子貯藏的淀粉而不是卵細胞貯藏的營養物質。這種情況與刺五加(劉林德等,1998)類似。球胚期,胚柄最為發達,不但將胚體推向胚乳本體之中,同時與孢子體相連,吸收并傳輸來自珠被組織的營養物質,供胚體細胞迅速增殖。球胚后期,胚柄開始退化,胚體周圍的胚乳細胞被消化水解,并浸在胚乳水解液的空腔里,推測胚體表層細胞吸收胚乳水解的營養物質供胚體進一步發育。3.3質膜內陷的存在機制在大車前胚胎發育過程中,質膜內陷大量存在。在胚柄細胞間、胚體細胞間以及胚柄、胚體與胚乳細胞相連的細胞之間很少出現胞間連絲,但均存在質膜內陷。質膜內陷的細胞的細胞質內存在較豐富的內質網、高爾基體及其分泌小泡,質膜外方的質膜內陷處存在許多小泡物,質膜與細胞壁之間也存在大量的小囊泡結構。質膜內陷的形成與高爾基體產生的分泌小泡外排可能直接相關,推測通過此過程將細胞器合成的糖類、酶類外輸,參與細胞壁的構建以及細胞間的物質交換;質膜內陷的存在,擴大了質膜的表面積,從而增加分泌與吸收營養物質的效率。由此認為,質膜內陷可以作為細胞代謝活躍的形態學標志之一。3.4烏氏體及花粉粒周圍嗜顆粒郭潔等(1989)在甜葉菊的絨氈層細胞內,胡適宜等(1992)在春蘭花藥的藥壁表皮細胞內,姚雅琴和楊天章(1996)在小麥花藥的藥室內壁細胞、藥室表皮細胞、絨氈層附近、烏氏體和花粉