小柴胡顆粒中5種主要指標性成分的含量測定

小柴胡湯是小柴胡湯的原始制備。它是治療少陽病的主要方劑。它由柴胡、黃甘草、黨參、半夏、生姜和棗組成。現代藥理研究表明,小柴胡湯具有廣泛的藥效,該方有較好的解熱作用,能抑制發熱動物體溫的升高,體外可抑制多種細菌生長,對肝臟、胰臟、肺臟和胃腸功能有調節和保護作用,在臨床上有廣泛的應用。目前對小柴胡顆粒的質量控制多采用薄層鑒別法、高效液相色譜法、薄層掃描法等對黃芩苷、甘草酸、柴胡皂苷等成分進行定量分析,這些方法測定成分單一,難以全面評價小柴胡顆粒的質量。而用于中藥質量控制的色譜特征譜,比目前沿用的方法所提供的信息更加豐富,它通過抽提復方中具有藥材歸屬的特征信息,利用其中特征數據的比較,可以準確靈敏地反映出復方的質量特性,在對復方質量評價的全面性以及復方藥材組合關系的分析上有著良好的識別和鑒別功能,可為大復方物質基礎的研究提供一種有效的途徑。應用色譜特征譜控制中藥復方制劑的質量,是中藥復方制劑走向國際的前提條件。因此本研究在建立了HPLC同時測定小柴胡顆粒中黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素和甘草次酸5種有效成分含量方法的同時,還對10批小柴胡顆粒進行了色譜特征譜的分析與探討,為小柴胡顆粒的內在質量控制提供了一種較為全面的分析手段。小柴胡顆粒的提取Agilent1100型高效液相色譜儀,包括在線脫氣裝置、自動進樣器、柱溫箱、DAD檢測器(美國Agilent公司)。黃芩苷(baicalin,批號:101009)、黃芩素(baicalein,批號:101107)、漢黃芩苷(wogonoside,批號:110325)、漢黃芩素(wogonin,批號:101229)和甘草次酸(enoxolone,批號:101231)對照品均購自上海融禾醫藥科技有限公司,純度均>98.0%,10批小柴胡顆粒均購自南京各大藥房(表1)。精密稱取黃芩苷15.54mg、黃芩素10.00mg、漢黃芩苷8.24mg、漢黃芩素8.90mg和甘草次酸8.10mg,置于10mL量瓶中,用甲醇稀釋并定容至刻度,搖勻,即得質量濃度分別為1.55、1.00、0.82、0.89和0.81mg·mL-1混合對照品儲備液。臨用前,用甲醇將混合對照品儲備液逐級稀釋得6個濃度水平的混合對照品工作溶液,供作標準曲線用。取小柴胡顆粒適量,研細,精密稱取約1.50g,置具塞錐形瓶中,精密加入70%乙醇50mL,密塞,稱定重量,超聲提取30min,放冷,再稱定,用70%乙醇補足失重,搖勻,濾過,取續濾液,即得。色譜柱:AgilentKromasilC18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm),保護柱:C18(50mm×4.6mm);流動相:A相為0.1%磷酸水溶液,B相為乙腈,線性梯度洗脫程序:0~10min,0~10%B;10~15min,10%~20%B;15~25min,20%~40%B;25~35min,40%~42%B,35~45min,42%~100%B;45~50min,100%B;流速:1.0mL·min-1;檢測波長:254nm;柱溫:25℃;進樣量:10μL。結果1小柴胡的含量是測量的1.1線性范圍及檢出限各混合對照品工作溶液分別在6個濃度點平行測定3次。以對照品進樣質量X(mg)對色譜峰面積Y進行線性回歸。根據本實驗結果,對于待定量的5種物質,在最優化實驗條件下,峰面積值與供試品質量呈線性關系,回歸方程、線性范圍、相關系數及檢出限結果見表2。結果表明各成分在各自濃度范圍內線性關系良好。1.2方法的回收率測定試驗分別精確吸取含量分析用混合對照品工作溶液10μL,重復進樣6次,以峰面積值為指標計算RSD(n=6),考察方法的精密度。按“供試品溶液的制備”項下方法平行制備6份供試液,在含量分析色譜條件下,測定5種成分含量,以峰面積值為指標計算RSD(n=6),考察方法的重復性。取上述供試液,分別間隔0、1、2、4、8、12和24h進樣分析,測定5種成分含量,以峰面積值為指標計算RSD(n=6),考察供試品的穩定性。在已知各成分含量的待提取供試品中分別定量加入5種成分的混合對照儲備液,考察方法的平均回收率(n=6)。精密度、重復性、穩定性及回收率結果見表3。1.3不同制造商的小柴胡顆粒含量分析分別測定10個不同廠家生產的小柴胡顆粒中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素和甘草次酸的含量,結果見表4。2小柴胡顆粒特征家譜2.1小柴胡顆粒相似度評價以出峰時間居中、峰面積較大的黃芩苷作為參照峰,采用國家藥典委員會相似度評價系統(2004Af)軟件對10批小柴胡顆粒進行相似度評價,共標定了12個共有峰作為特征峰,圖1為10批樣品特征譜(a)和共有模式圖譜(b)。10批樣品圖譜的相似度分別為0.976、0.971、0.982、0.908、0.973、0.981、0.923、0.959、0.958和0.966。2.2穩定性測定法制備6份平行樣品,在特征圖譜色譜條件下,考察方法的重復性;取其中一份樣品連續進樣6次,考察方法的精密度;間隔0、1、2、4、8、12和24h分析同一樣品,考察樣品的穩定性。以3號峰黃芩苷為參照峰,分別計算相對保留時間、相對峰面積和RSD。實驗結果表明,在重復性、精密度和穩定性方法學考察中分別有10個、10個和9個峰相對峰面積RSD小于3.0%,12個峰相對保留時間RSD小于3.0%,符合特征圖譜的要求。小柴胡顆粒成分組成小柴胡顆粒中君藥是柴胡,臣藥是黃芩,佐藥是甘草。黃芩主要含黃酮類化合物,具有抗菌、抗病毒、抗炎和解熱作用,其中黃芩素、黃芩苷、漢黃芩苷和漢黃芩素是主要的有效成分。還有研究認為甘草次酸有很好的抗炎作用。因此可以選擇黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素和甘草次酸作為小柴胡顆粒的質量控制指標。本研究對小柴胡顆粒中主要指標性成分黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素和甘草次酸進行了含量分析,同時建立了小柴胡顆粒的特征圖譜。研究表明,小柴胡顆粒相應的共有峰均已在色譜圖上有所體現,雖然各峰面積略有不同,這說明小柴胡顆粒中的各地藥材的組成成分在含量上有一定差異,但相似度評價結果表