lncRNANEAT1在乳腺癌腫瘤相關巨噬細胞中的表達及作用機制

司剛，司貞，鐘國南，錢麗華(1?？谑袐D幼保健院藥學部，?？?70102；2瓊海市中醫院藥學部；3海南醫學院基礎醫學與生命科學學院)乳腺癌(breastcancer)是女性最常見的惡性腫瘤之一。近年來，隨著環境與生活方式的改變，乳腺癌的發病率急劇上升，嚴重威脅女性生命健康[1-3]。目前臨床應用的多數治療策略僅針對乳腺細胞，而忽視了對腫瘤微環境的改善，但研究表明，腫瘤微環境在乳腺癌的發生發展中起著重要作用[4,5]。腫瘤微環境是腫瘤細胞生存的復雜環境，主要由腫瘤細胞、免疫細胞、基質細胞和細胞外基質組成[5]。其中巨噬細胞作為腫瘤間質中的重要細胞群，能通過呈現特殊的表型特征參與調控腫瘤的發生與進展[6-8]。有數據表明腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associatedmacrophages，TAMs)能促進乳腺癌細胞增殖、侵襲、轉移和免疫逃逸，并促使腫瘤細胞對多種藥物產生耐藥性等[7-9]。因此，積極探究調控乳腺癌微環境中TAMs分化及功能的相關機制具有重要意義。長鏈非編碼RNA(longnon-codingRNA,lncRNA)是一類長度超過200個核苷酸的非編碼RNA，其在生物體的生命運動、基因表達、細胞周期和個體發育以及免疫細胞分化等方面發揮重要作用[10,11]。既往研究報道，lncRNANEAT1在乳腺癌組織與細胞中的表達呈異常升高現象，且與較高的組織學分級和患者不良預后密切相關[12-16]。近年來進一步的研究證實，lncRNANEAT1可在體內外通過多種途徑促進乳腺癌細胞的增殖、侵襲與遷移[13-16]。而在其他疾病中，lncRNANEAT1還能通過調控巨噬細胞的分化，從而參與調控疾病的進展[17,18]，但在乳腺癌微環境中高表達lncRNANEAT1是否同樣能夠參與調控TAMs的形成與維持尚不清楚。因此，本研究通過體內外實驗探究lncRNANEAT1在乳腺癌中TAMs的作用，以期進一步闡明乳腺癌的發生與發展的相關機制。1材料與方法1.1臨床樣本來源選取自2019年10月至2021年1月?？谑袐D幼保健院確診的30例乳腺癌患者的腫瘤組織和30例健康體檢患者的外周血作為臨床樣本。乳腺癌患者的年齡在33～77歲之間，平均年齡為(55.4±9.2)歲。臨床病理學分析顯示，Ⅰ～Ⅱ期患者21例、Ⅲ期患者9例,淋巴結轉移患者10例。對照組年齡在37～79歲之間，平均年齡為(58.6±8.4)歲，兩組受試者的年齡差異無統計學意義(P>0.05)。納入標準：①兩組受試者均為女性患者；②乳腺癌患者術后診斷診斷為原發性乳腺癌，且術前均未接受放療、化療或免疫抑制劑等相關治療；③兩組受試者均未合并其他組織或臟器的原發性惡性腫瘤、免疫系統及內分泌等相關疾??；④兩組受試者的臨床資料完整，且患者及家屬知情同意。使用葡聚糖-泛影葡胺密度梯度離心法分離乳腺癌組織中的TAMs(TAMs組)和健康體檢患者外周血中的外周血單個核細胞(peripheralbloodmononuclearcell，PBMC)(PBMC組)，并使用RT-PCR實驗檢測巨噬細胞在TAMs組與PBMC組中的極化水平及lncRNANEAT1的表達。本研究獲得我院醫學倫理委員會批準，所有受試者均簽署知情同意書。1.2主要材料與試劑乳腺癌細胞系MCF-7購自美國ATCC菌株保藏中心;人單核巨噬細胞THP-1與小鼠巨噬細胞系Raw264.7均購自武漢普諾賽生命科技有限公司；30只6周齡的雌性BALB/c裸鼠購自海南藥物研究所有限責任公司；靶向沉默lncRNANEAT1基因表達和陰性對照的慢病毒載體(LV-shNEAT1與LV-NC,病毒滴度為4×108TU/ml)由江蘇金斯瑞生物科技有限公司構建與合成；MTT試劑，RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒(美國Thermo公司)；SYBRPremixExTaqTM試劑盒(日本TaKaRa公司)；Transwell小室(0.4μm與8μm孔徑)(美國Millipore公司)；Matrigel基質膠(美國BD公司)；RPMI-1640培養基(美國Hyclone公司)；胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)(購自美國Gibco公司)；Ficoll淋巴細胞分離液、Ⅳ型膠原酶、DNaseⅠ酶、佛波酯(PMA)、青霉素(100U/ml)與鏈霉素(100μg/ml)混合溶液、干擾素-γ(interferonγ，IFN-γ),白細胞介素-4(interlukin-1,IL-4)，脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)(美國Sigma公司)；兔抗小鼠TNF-α,人類白細胞抗原DR(humanleukocyteantigen-DR，HLA-DR),精氨酸酶-1(Arginase-1，Arg-1)抗體(美國Abcam公司)；兔抗小鼠CD163、CD206、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH)(美國JacksonImmuno-Research公司)；兔抗小鼠E-鈣黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)和鋅指轉錄因子Snail抗體(美國CellSignalingTechnology公司)；NanoDrop分光光度計(ThermoFisherScience公司);光學倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；RT-PCR儀(iQ型,美國Bio-Rad公司)；RT-PCR引物由廣州銳博生物科技公司合成。1.3方法1.3.1乳腺癌組織中TAMs與外周血中巨噬細胞的分離Reference方法[19]從乳腺癌患者新鮮腫瘤組織中分離TAMs，簡述如下：滅菌外科剪剪碎分散乳腺癌組織塊，0.3%的Ⅳ膠原酶、DNaseⅠ與透明質酸混合液于37℃水浴鍋中消化溶解2h，加入紅細胞裂解液以去除紅細胞，0.125%的胰蛋白酶繼續攪拌消化45min后，70目濾網過濾后，取過濾液，2200r/min離心10min，取下層沉淀，PBS溶液重懸后，使用等體積的Ficoll淋巴細胞分離液利用葡聚糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)密度梯度離心法在室溫下分離上述乳腺癌組織消化液中的巨噬細胞，離心純化后收集細胞。外周血中單個核細胞的分離：使用含EDTA抗凝管收集健康對照組的肘靜脈血8ml，2200r/min離心5min，取底層細胞沉淀，同樣利用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法于室溫下分離PBMC，離心純化后收集PBMC進行后續實驗。1.3.2細胞的培養與巨噬細胞的誘導MCF-7、THP-1和Raw264.7細胞均培養于含10%FBS與1%青霉素與鏈霉素雙抗溶液的RPMI-1640完全培養基中，并置于37℃、5%CO2恒溫恒濕培養箱中進行培養。取處于對數生長期的THP-1，使用50ng/ml的PMA刺激THP-1細胞48h使其活化為M0型貼壁細胞。Reference方法[20]聯合使用300ng/mlLPS與30ng/mlIFN-γ處理貼壁后的THP-1與Raw264.7細胞進行M1型巨噬細胞的誘導，使用20ng/ml的IL-4處理上述細胞進行M2型的誘導分化。24h后使用RT-PCR實驗檢測誘導后的巨噬細胞中M2型標記分子Arg-1、CD206和CD163與M1型標記分子TNF-α和HLA-DR的mRNA表達水平進行鑒定M1與M2型巨噬細胞的極化。1.3.3慢病感染與細胞分組取生長狀態良好的Raw264.7細胞，細胞計數后，按5×105個/孔接種至6孔板中，待細胞生長融合至70%時，按加入含LV-shNEAT1或LV-NC的慢病毒顆粒轉染液，感染指數(multiplicityofinfection,MOI)為25。將慢病毒轉染液與細胞緩慢充分混勻后，置于37℃、5%CO2恒溫恒濕培養箱中進行培養，8h更換為含10%的RPMI-1640培養液，感染48h后，收集細胞進行RT-PCR檢測感染效率。繼續培養3d后，使用含10%FBS與2mg/L的嘌呤霉素的RPMI-1640培養液進行篩選以建立穩定感染LV-shNEAT1或LV-NC的細胞系。將Raw264.7細胞與乳腺癌細胞MCF-7在Transwell(0.4μm)共培養體系進行培養，并將共培養體系分為3組：LV-NC組、LV-shNEAT1組和control組。其中LV-NC組的Transwell共培養體系中上室為感染LV-NC的Raw264.7細胞，下室為MCF-7細胞；LV-shNEAT1組上室為感染LV-shNEAT1的Raw264.7細胞，下室為MCF-7細胞；control組上室為未轉染的Raw264.7細胞，下室為MCF-7細胞；各組共培養體系置于37℃、5%CO2恒溫恒濕培養箱中培養24h后分別用于EdU實驗、Transwell實驗和RT-PCR及Westernblot實驗檢測。1.4EdU法檢測細胞增殖取1.3中的各組Transwell共培養體系中MCF-7細胞，棄原培養液，每孔加入150μl終濃度為50μmol/L的EdU試劑，37℃下孵育2h后，將各組MCF-7細胞于4%多聚甲醛溶液中固定20min，然后加入2mg/ml甘氨酸5min，PBS充分洗滌后，0.5%TritonX-100透化細胞10min。再次用PBS洗滌后，加入終濃度為1mg/ml的DAPI試劑在室溫下孵育30min進行染核。最后熒光顯微鏡觀察拍照，其中EdU陽性(紅色)細胞表示正在進行DNA復制的增殖期細胞。實驗單獨重復3次。1.5Transwell實驗檢測細胞侵襲取生長狀態良好的MCF-7細胞，按5×105個/孔接種至預先包被BD基質膠的Transwell(8μm)上室中，下室為接種等密度的感染LV-NC或LV-shNEAT1或未轉染的Raw264.7細胞，并按1.3方法繼續分為LV-NC組、LV-shNEAT1組和control組，培養24h后取出小室，棉簽擦拭上室未穿出的細胞，95%酒精于室溫下固定15min，自然風干后，0.1%的結晶紫染色，PBS沖洗細胞3次，最后使用倒置顯微鏡進行觀察拍照。實驗單獨重復3次。1.6RT-PCR實驗檢測lncRNANEAT1和Arg-1、CD206、CD163、TNF-α及HLA-DR的mRNA表達水平取待測細胞，使用RNA提取試劑盒收集細胞中的總RNA，NanoDrop分光光度計進行定量后，反轉錄試劑盒進行逆轉錄合成cDNA，并以此為模板按照SYBRPreMixExTaqTM試劑盒說明書方法進行RT-PCR。反應條件：95℃預熱10min，95℃變性10s，60℃退火/延伸20s，40個循環周期。使用閾值周期(Ct)測定目標基因的表達水平，以GAPDH為內參，利用2-ΔΔCt法計算相對表達水平。RT-PCR引物序列見表1。表1RT-PCR引物序列Table1PrimersequencesofRT-PCR1.7Westernblot實驗檢測Arg-1、CD206、CD163、TNF-α、HLA-DR及E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和Snail的蛋白表達水平使用RIPA裂解液與蛋白酶抑制劑提取待測細胞中的總蛋白，BCA法進行定量，經加熱變性后，取約35μg蛋白樣品經10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離蛋白質，隨后轉移到PVDF膜，5%脫脂奶粉于室溫下封閉抗體1h，加入一抗：TNF-α(1∶1000),HLA-DR(1∶1000),Arg-1(1∶1000),CD163(1∶1000),CD206(1∶1000),N-cadherin(1∶800),N-cadherin(1∶800)、Vimentin(1∶500)和Snail(1∶500)和GAPDH(1∶1000)，4℃孵育過夜，隨后加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(1∶5000)二抗，最后加入化學發光液于凝膠成像系統中曝光拍照，ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內參。實驗單獨重復3次。1.8裸鼠皮下移植瘤實驗將30只飼養在SPF級環境下的雌性BALB/c裸鼠隨機分為3組：control組、LV-NC組和LV-shNEAT1組。其中control組向裸鼠注射含MCF-7細胞的PBS懸液；LV-NC組向裸鼠注射聯合注射感染LV-shNC的Raw264.7與MCF-7細胞；LV-shNEAT1組向裸鼠注射聯合注射感染LV-shNEAT1的Raw264.7細胞與MCF-7細胞。其中LV-NC組與LV-shNEAT1組小鼠于右側前肢腋下經皮注射約含1×105/ml個感染LV-shNC或LV-shNEAT1慢病毒的Raw264.7細胞與1×106/mlMCF-7的細胞懸液。control組僅注射同體積約含1×106/mlMCF-7細胞懸液。每2d測量腫瘤的長度與寬度，并監測腫瘤體積[=(長度×寬度2)/2]生長情況，持續28d。28d后脫頸處死各組小鼠，手術剝離腫瘤組織，拍照后，4%的多聚甲醛固定，石蠟包埋，制成2μm厚的連續切片進行蘇木精-伊紅(HE)染色與Ki-67的免疫組織化學染色以觀察腫瘤細胞的生長與增殖情況。1.9HE染色檢測移植瘤組織的病理學改變與免疫組織化學染色檢測Ki-67的表達HE染色：取固定于4%多聚甲醛溶液中的腫瘤組織，常規使用梯度酒精與二甲苯脫水透化，石蠟包埋，并切片(厚約4μm)后，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，蘇木精與伊紅染色，隨后再次使用梯度酒精與二甲苯脫水，封片后，倒置顯微鏡下觀察拍照。免疫組織化學染色：將腫瘤組織切片于二甲苯中脫蠟，梯度酒精水化，微波加熱已修復抗原后，使用3%的過氧化氫溶液浸泡以阻斷內源性過氧化物酶，PBS充分洗滌后，加入兔抗小鼠Ki-67，4℃下孵育過夜，隨后加入二抗，DAB試劑盒染色，蘇木素復染，最后使用ImageJ軟件分析，以累積吸光度值作為指標進行比較分析。其中細胞核為藍色，棕黃色為陽性表達。1.10統計學分析2結果2.1lncRNANEAT1在TAMs中的表達RT-PCR檢測結果顯示，與健康對照人群的PBMC相比，乳腺癌患者的TAMs中M2型巨噬細胞標記分子Arg-1、CD206和CD163的mRNA表達水平均顯著升高(P<0.05)，而M1型巨噬細胞標記分子TNF-α、HLA-DR的mRNA表達水平明顯降低(P<0.01，見圖1)。與PBMC相比，*P<0.05，**P2.2lncRNANEAT1在體外誘導的M2型巨噬細胞中高表達RT-PCR檢測結果顯示，在THP-1來源的巨噬細胞中，與M0型相比，M1型中lncRNANEAT1的表達水平顯著降低(P<0.05)，但M2型巨噬細胞中的表達水平明顯升高(P<0.05)，但在M2型中的表達水平明顯升高(P與同來源M0型相比，*P<0.05；與同來源M1型相比，##P2.3沉默lncRNANEAT1表達對巨噬細胞極化的影響RT-PCR檢測結果顯示，與未轉染的RAW264.7細胞相比，轉染LV-shNEAT1的細胞中lncRNANEAT1表達水平顯著降低(P0.05，見圖3A)。RT-PCR和Westernblot檢測共培養體系中RAW264.7細胞中M1型和M2型分子標記物的mRNA和蛋白表達水平的結果顯示，與control組相比，LV-NC組和LV-shNEAT1組RAW264.7細胞中Arg-1、CD206、CD163的mRNA和蛋白表達水平均顯著增加(P<0.05)，而TNF-α、HLA-DR的mRNA和蛋白表達水平表達均明顯降低(P<0.05)；但與LV-NC組相比，LV-shNEAT1組RAW264.7細胞中TNF-α、HLA-DR的mRNA和蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)，而Arg-1、CD206、CD163的mRNA和蛋白表達水平均明顯降低(PC.Westernblot檢測沉默lncRNANEAT1的表達對各組RAW264.7細胞分化的影響與RAW264.7巨噬細胞相比，&P<0.05；與control組相比，*P<0.05；與LV-NC組相比，#P2.4沉默巨噬細胞中lncRNANEAT1表達對乳腺癌細胞增殖能力的影響EdU檢測結果顯示，與control組相比，LV-NC組和LV-shNEAT1組中MCF-7的EdU陽性率均顯著升高(P<0.05)，而與LV-NC組相比，LV-shNEAT1組中EdU陽性率卻明顯降低(P<0.05，見圖4)。紅色為EdU陽性，細胞核為藍色圖4EdU染色檢測各組乳腺癌細胞的增殖能力Figure4TheproliferationabilityofbreastcancercellsinvariousgroupsbyEdUstaining2.5沉默巨噬細胞中lncRNANEAT1表達對乳腺癌細胞上皮細胞-間充質轉化(EMT)能力的影響Westernblot實驗檢測結果顯示，與control組相比，LV-NC組和LV-shNEAT1組MCF-7細胞中E-cadherin蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，N-cadherin、Vimentin和Snail蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)；而與LV-NC組相比，LV-shNEAT1組MCF-7細胞中E-cadherin蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，N-cadherin、Vimentin和Snail蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05，見圖5)。與control組相比，*P<0.05；與LV-NC組相比，#P2.6沉默巨噬細胞中lncRNANEAT1表達對乳腺癌細胞侵襲能力的影響Transwell侵襲實驗檢測結果顯示，與control組相比，LV-NC組和LV-shNEAT1組MCF-7細胞侵襲能力均顯著升高(P<0.05)，而與LV-NC組相比，LV-shNEAT1組中乳腺癌細胞侵襲能力明顯降低(P<0.05，見圖6)。與control組相比，*P<0.05；與LV-NC組相比，#P2.7沉默巨噬細胞中lncRNANEAT1表達對乳腺癌移植瘤生長的影響裸鼠皮下移植瘤實驗結果顯示，與control組相比，LV-NC組和LV-shNEAT1組乳腺癌移植瘤的生長速度和腫瘤質量均顯著升高(P<0.05)，而與LV-NC組相比，LV-shNEAT1組乳腺癌移植瘤的生長速度和腫瘤質量均明顯降低(P<0.05，見圖7A)。移植瘤組織的HE染色結果表明，與control組相比，LV-NC組和LV-shNEAT1組腫瘤細胞核增大，染色加深，而LV-NC組又較LV-shNEAT1組的變化更為顯著；移植瘤組織中Ki-67染色結果顯示，與control組相比，LV-NC組和LV-shNEAT1組Ki-67陽性率明顯升高(P<0.05)，而與LV-NC組相比，LV-shNEAT1組Ki-67陽性率顯著降低(P<0.05，見圖7B)。B.各組裸鼠移植瘤組織的HE染色與Ki-67陽性表達率圖7沉默巨噬細胞中lncRNANEAT1表達乳腺癌移植瘤生長的影響Figure7EffectofsilencinglncRNANEAT1expressioninmacrophagesonthegrowthofbreastcancerxenografts3討論最近的研究證實lncRNA在腫瘤的發展中起著關鍵作用，這對未來新治療靶點的研發具有重要啟示意義[10]。盡管國內外學者已報道，lncRNANEAT1參與乳腺癌的增殖與侵襲，但其在TAMs的極化與維持中的作用尚不清楚。本研究通過體內外水平，系統探究了lncRNANEAT1在調控乳腺癌TAMs極化和功能中的作用，進一步解析了lncRNANEAT1在乳腺癌發生發展中的機制，為臨床的應用研究提供了一定的實驗室依據。如前所述，巨噬細胞是腫瘤基質中的一個重要群體，其能通過經典激活的M1型和交替激活的M2型來改變其功能，以參與腫瘤的發生與進展[6-8]。M1巨噬細胞通過表達促炎因子(如TNF-α)參與炎癥反應，而在實體腫瘤微環境中，外周血單核細胞通過血管滲入腫瘤組織主要分化為M2型，即TAMs，并分泌相關細胞因子如白介素-4(interlukin-4,IL-4)或IL-10，以促進血管生成、基質合成和免疫逃逸[6,7]。研究表明，在腫瘤發展的初級階段，外周血單核細胞通過血管滲入腫瘤組織并極化為M1型巨噬細胞，并通過產生TNF-α、活性氧等發揮吞噬與促炎作用，從而抑制腫瘤細胞的生長。但在腫瘤發展的中晚期，腫瘤微環境培養的巨噬細胞分泌IL-10和TGF-β，通過抑制細胞毒性T淋巴細胞和自然殺傷細胞的激活，來促進腫瘤的進展[6-9]。在本研究中，課題組通過檢測M1型標志分子TNF-α、HLA-DR和M2型標志分子Arg-1、CD206、CD163來評估乳腺癌患者腫瘤組織中的M2型巨噬細胞比例，結果證實，與正常對照人群的PBMC相比，乳腺癌組織中的M2型巨噬細胞表達水平顯著升高。這與既往研究結果一致，均提示乳腺癌微環境能夠誘導外周血M0型單核巨噬細胞向M2型極化，即TAMs主要以M2型巨噬細胞為主。同時，本實驗結果還顯示，在TAMs中，lncRNANEAT1表達水平明顯升高。結合之前國內外學者報道的lncRNANEAT1在乳腺癌組織中存在異常高表達的現象[12-16]，上述結果并不意外。同時，為進一步研究lncRNANEAT1在人源性與小鼠源性的M2型巨噬細胞中的高表達水平，課題組在體外誘導人單核巨噬細胞系THP-1與小鼠巨噬細胞系RAW264.7的M1與M2型分化，結果再次表明，lncRNANEAT1在M2型巨噬細胞中的表達水平顯著增加，而M1型中的表達水平明顯降低。這進一步說明lncRNANEAT1參與調控巨噬細胞的M1與M2型極化。M2型巨噬細胞，也稱為交替激活的巨噬細胞，可通過IL-4、IL-13或TGF-β誘導單核細胞分化形成[20]。M2巨噬細胞可通過釋放抗炎因子(如IL-10和TGF-β)、免疫抑制因子(如前列腺素E2、Arg-1、生長抑素)等來促進腫瘤細胞的增殖、EMT與侵襲能力[21,22]。最新研究報道，lncRNANEAT1可在多種疾病中調控巨噬細胞的M2型分化，如Zhang等[23]在脈絡膜新生血管中發現，lncRNANEAT1可通過發揮競爭性RNA的功