雞胚成纖維細胞感染馬立克氏病后部分染色體上微衛星的變化

馬立克病（mdv）是由馬立克病病毒（mdv）引起的一種嚴重的雞淋巴腫瘤性疾病。mdv感染可能會導致主觀免疫抑制。這是目前和將來最重要的雞育種疾病之一。微衛星(microsatellite,MS)是廣泛存在于原核及真核細胞基因組中的簡單串聯重復的DNA序列,約占人類基因組的10%1材料和方法1.1實驗用微衛星引物實驗所用雞胚購自南京藥械廠;馬立克氏病毒超強毒株RB-1B株,由南京農業大學動物醫學院動物免疫診斷與免疫重點實驗室惠贈;本實驗中所用的微衛星引物由日本農業生物科學研究所惠贈;小牛血清、MEM由Gibco公司生產;胰蛋白酶購自華美生物工程公司;Taq酶,PUC18DNA/MspI,購自南京天為生物科技有限公司;尿素、過硫酸銨、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、硼酸與Trisbase,TEMED由Amresco公司生產;AgNOCO1.2馬立克病毒對雞胚細胞生長的影響取21個孵化9~11日齡SPF雞胚,按常規雞胚成纖維細胞培養。待細胞大約80%鋪滿細胞培養瓶壁時,來自同一雞胚個體的CEF一半接種馬立克病毒超強毒株RB-1B株,一半不接毒作為對照。攻毒后第5天,有90%的細胞出現典型的細胞病變時,收集細胞,采用常規的細胞基因組DNA提取法提取DNA1.3pcr擴增試驗提取的DNA作模板,用雞5,6,7,8,9號染色體上的43對微衛星引物,進行PCR擴增采用25μL的反應體系:基因組DNA(大約50ng/μL)1μL,引物(10pmol/μL)1μL,Taq酶1.25U,10×PCR緩沖液(Mg首先94℃,預變性1min15s,采用循環三相。第一相共10個循環,94℃變性15s,60℃退火30s,68℃延伸1min。第二相共10個循環,94℃變性15s,55℃退火30s,68℃延伸1min。第三相共30個循環,94℃變性15s,50℃退火30s,68℃延伸1min。最后68℃延伸9min。1.4聚丙烯酰胺變性凝膠電泳取4μLPCR擴增產物,上樣至10%聚丙烯酰胺變性凝膠內,160V電壓電泳2~3h,電泳凝膠銀染,成像系統拍照分析結果。1.5pcr擴增效果目前國際MSI工作站推薦一組檢測微衛星標志物至少應為5個,其中有≥2個標志物發生MSI時為MSI-H,1個標志物發生MSI時為MSI-L,沒有MSI發生時為MSS判斷樣本是否有MSI:比較同時電泳上樣的染毒CEF和其同源正常CEF基因組DNA的PCR產物的PAGE條帶,與正常對照相比,若某一微衛星位點的等位基因條帶增多或位置發生改變,則記為MSI。2結果與分析2.1纖維細胞培養的結果待CEF細胞貼壁長成單層,大約有80%鋪滿底壁時(圖1),接毒超強毒株RB-1B株,在CO2.2聚丙烯酸-冷凝膠電泳的結果同一個引物不同樣品的電泳圖。2.3微衛星標記多態性檢測由表1可見,5,6,7,8,9號染色體的43個微衛星標記,其中38個位點發生不同百分率的MSI,5個標記沒有檢測到變化,占微衛星標記5/43(11.63%)。檢測到有MSI的微衛星位點表現不同的百分率,其中ABR0262的MSI發生率最高為38.10%,ABR0048,ABR041,MCW0183次之,其MSI均為33.33%。MSI最低為4.76%,這樣的位點有7個,占微衛星標記的比率為7/43(16.28%)。2.4樣品制備方法hdmi由表2可見,21組樣品中,9號樣品,MSI發生率最高為41.86%。11,6號樣品的發生率也較高,分別為32.56%,27.91%。3組樣品檢測到MSI的發生率為25.58%;1組樣品檢測到MSI發生率為16.28%;1組樣品檢測到MSI發生率為11.63%;4組樣品檢測到MSI發生率為9.30%;6組樣品MSI發生率為6.98%;1組樣品檢測到MSI發生率為4.65%;2組樣品的MSI發生率最低為2.33%。10個位點MSI的發生率在20%以上,占總微衛星標記的10/43(23.26%);21組雞胚19組出現兩個或兩個以上位點出現基因組變化。3種病毒在色體上的微衛星不穩定性微衛星不穩定性(MSI)與腫瘤之間的關系是近年來腫瘤學研究的熱點之一,產生MSI的機制及其與腫瘤發生關系的研究已取得很大進展。MSI是基因組不穩定性的標記,它在MSI腫瘤細胞增殖期間逐漸發展的一個動力學過程本實驗通過對雞胚成纖維細胞感染馬立克氏病毒后部分染色體上微衛星不穩定性研究發現,宿主基因組微衛星不穩定性的變化是隨機的,但也有一定的規律,而且這些變化可以用微衛星標記來檢測。5,6,7,8號染色體上43個微衛星位點MSI的發生頻率存在差異。43個位點中,ABR0262的MSI發生率最高為38.10%,ABR0048,ABR041,MCW0183次之,他們的MSI均為33.33%。MSI最低為4.76%,這樣的位點有7個,占微衛星標記的比率為7/43(16.28%)。10個位點MSI的發生率在20%以上,占總微衛星標記的10/43(23.26%);21組雞胚中19組出現兩個或兩個以上位點出現基因組變化。夏繼飛由于檢測的位點和數量不同,不同染色體上或同一染色體上不同位點間MSI頻率差異可能很大。MD可能是MSI瘤,馬立克腫瘤的發生、發展涉及不同基因的多部位、多步驟的改變。本實驗中MSI率與以前研究結果4mdv致瘤機理解析微衛星標記研究能夠揭示MDV感染宿主后的致瘤機理。微衛星標記可以揭示宿主基因組尤其是腫瘤基因組發生了哪些變化,特別是對錯配修復基因突變的探查,動態的研究還能了解變化的順序及過程。故而針對宿主的基礎研究結合病毒功能基因組的研究成果,就比較容易解析MDV感染宿主后的致瘤機理。腫瘤的發生發展與染色體數量、結構異常密切相關,分析某種腫瘤高頻率的染色體改變將為腫瘤易感基因的篩選提供定位資料。MD是由MDV引起的腫瘤性疾病,在發病前如能監測或診斷出MDV致瘤株的感染,對避免雞場的損失非常關鍵。事實上,MD腫瘤的形成是本病的關鍵所在。在腫瘤形成前作出診斷是目前MD研究所缺乏的。本試驗中篩選到的