提高分離度R，需要分別增大n，α，k值n：柱效，易受柱長、填料粒徑的影響α：選擇性，易受流動相和固定相影響；k：保留因子，受固定相和流動相的影響色譜分離基本方程HPLC柱的“色品”表達式第1頁/共49頁柱效（n）對分離度（R）的影響以上兩張譜圖k,α值完全相同，僅僅由于柱效高低不同使得它們具有不同的分離度。“高富帥”第2頁/共49頁分離選擇性（α）對分離度（R）的影響

α=1.04α

=1.35α

=1.50

改變分離選擇性α的方法改變固定相改變流動相pH值改用不同的流動相

改變柱溫第3頁/共49頁容量因子（k）對分離度（R）的影響容量因子大于10，k/(k+1)的改變不大，而分析時間將大大延長。因此，k的最佳范圍是1<k<20。改變容量因子的方法有：減小柱死體積改變柱溫改變流動相的配比梯度洗脫第4頁/共49頁αk'N如何控制分辨率?第5頁/共49頁

影響色譜柱性能的因素6色譜柱與色譜填料的特性1、柱填料

硅膠純度粒徑（及粒徑分布）比表面積孔徑2、色譜柱的構型

色譜柱直徑色譜柱長度3、固定相鍵合類型殘余硅羥基的影響反相鍵合相的保留行為鍵合硅膠的穩定性物理因素化學因素第6頁/共49頁AggregationPolymerization堆砌法硅膠Innoval、UHP、Bonshell

優點：高機械強度，耐污染共聚法硅膠Venusil、Durashell優點：分離效果佳

硅膠制作工藝第7頁/共49頁硅膠基質反相色譜分離三要素固定相流動相反相作用氫鍵作用弱離子交換作用反相作用氫鍵作用弱離子交換作用-R-OH-O-H+甲醇/乙腈水緩沖鹽溶液目標物A、B疏水部分（鏈烴和芳香烴）羥基、氨基離子化基團第8頁/共49頁109876543210pHk’2486弱堿弱酸pH=pKORCOHORCOpH對分離的重要影響調節ph值對樣品的分離非常有效第9頁/共49頁色譜柱固定相穩定性400-6068-099第10頁/共49頁400-6068-099Agela色譜柱最佳pH適用范圍第11頁/共49頁中等pH下使用C18

VenusilMPC18(2),孔徑110?

特點：親水性、通用性、

良好分離能力

第12頁/共49頁雙層表面處理技術減低硅膠表面硅羥基的活性第13頁/共49頁中等pH下良好的分離能力色譜柱：C18，5μm，4.6×250mm，樣品：嗎啡、可待因，脫氫嗎啡的分離，流動相:乙腈-25mM乙酸鈉緩沖液（

pH3.5）=10：90，色譜柱A，硅羥基pH=3.5流動相pH=3.5，未能抑制硅羥基的活性二次保留嚴重VenusilMPC18（2），硅羥基pH=5.2流動相pH=3.5，能充分抑制硅羥基的活性抑制了二次保留效應400-6068-099第14頁/共49頁100%水流動相的兼容性

樣品：尿苷

色譜柱：4.6*150mm,5μm

流動相：100%水

流速：1mL/min

溫度：30℃第15頁/共49頁MPC18(2)pH2.6MPC18(2)pH5.8AtlantisT3pH2.6AtlantisT3pH5.8堿性化合物阿米替林在不同pH下保留時間的變化第16頁/共49頁YMCODS-AQpH2.6YMCODS-AQpH5.8HydroRPpH5.8HydroRPpH2.6第17頁/共49頁中等PH值范圍，堿性化合物沒有三乙胺添加劑也可提供更好的峰型第18頁/共49頁耐污染，高壽命，高耐受性的XBPC18

(L)孔徑：150?雜質不易進入空隙而強保留表面積減小，減小極性小物質的保留時間色譜柱：5μm，4.6×250mm；樣品：蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃甲醚；流動相：甲醇:0.1%磷酸=80:20；波長：254nm；柱溫：室溫；流速：1.0mL/min第19頁/共49頁高pH值流動相優勢流動相pH對RPC保留的影響與樣品類型（酸、堿、中性）的關系色譜柱：4.6*250mm，5μm，C18，流動相：0.025M磷酸鹽、40%甲醇；樣品：1水楊酸；2苯巴比妥；3非那西丁；4尼古丁；5甲基丙苯丙胺400-6068-099第20頁/共49頁核心技術-表面雜化技術寬泛的pH使用范圍(2.0-12.0)

低硅羥基活性

高pH下擁有良好的壽命

對堿性化合物有很大的載樣量，適用于制備Durashell液相色譜柱：

DurashellC18，C18(L)，C8第21頁/共49頁高pH條件首選

老化條件流動相：甲醇:pH=12三乙胺溶液=40:60流速：1.0ml/min;柱溫：40℃;色譜柱：4.6×150；5μm；200?測試條件流動相：甲醇:水=85:15流速：0.8ml/min檢測波長：254nm;柱溫：30℃;進樣量：1μL色譜柱：4.6×150；5μm；200?樣品：尿嘧啶、苯酚、硝基苯、萘250h后初始：0h第22頁/共49頁強酸下使用的ASBC18色譜柱R=異丙基，防止鍵合相流失

優勢

適用于pH0.8-4的流動相使得對pH較敏感的分離得到優化極低pH有較好的柱效和使用壽命第23頁/共49頁酸性條件下的良好壽命第24頁/共49頁酸性條件分離酸性物質第25頁/共49頁

親水作用液相色譜柱

VenusilHILIC第26頁/共49頁與被分析物極性基團相互作用：增加極性化合物的保留與硅膠表面殘余硅羥基相互作用：改善拖尾，改善極性化合物的峰型，提高分離效率；分離機理反相液相色譜（RPLC）是最廣的色譜分離技術，可解決多種分析應用問題，但對某些分析物，特別是極性和親水性化合物卻無法或很少保留。長期以來，人們采用正相液相色譜(NPLC)，并使用不利環保的非水溶性流動相如己脘或環己脘來分析這些物質。但是在這種實驗條件下，很多極性和親水化合物往往很難溶解，從而限制了NPLC的應用范圍。從現在起有了另一種新的解決辦法，即選用親水作用液相色譜-HILIC。第27頁/共49頁VenusilHILIC色譜柱：益母草中鹽酸水蘇堿的測定（中國藥典2010版修訂品種）對照品：理論板數（22757）、對稱性（0.94）供試品：理論板數（17400）、對稱性（0.80）色譜柱：VenusilHILIC柱(丙基酰胺鍵合硅膠)，100?，4.6×250mm，5μm流動相：乙腈-0.2％冰醋酸溶液（80:20）；流速：0.5ml/min檢測：蒸發光散射檢測器（ELSD）；進樣量：20μl；柱溫：20℃鹽酸水蘇堿第28頁/共49頁葡萄糖分析流動相：乙腈－水（80∶20）流速：1ml/min柱溫：30℃檢測器：蒸發光散射檢測器α-D-葡萄糖β-D-葡萄糖氨基柱：氨丙基鍵合硅膠VenusilHILC：丙基酰胺鍵合硅膠第29頁/共49頁分離水溶性維生素Time樣品:VB1,VB6,VC,VB2色譜柱:VenusilHILIC4.6x150mm,5um流動相:0.1%TFA:ACN=90:10流速:1.0mL/min;檢測波長:280nm;Temp:30℃；第30頁/共49頁地西他濱和雜質的分離色譜柱:VenusilHILIC4.6×150mm,5μm，流動相:ACN:H2O＝96:4;1ml/min;UV:244nm;roomtemp第31頁/共49頁Agela極其豐富的鍵合相各種專用柱（阿奇霉素專用柱、左卡尼丁專用柱、糖柱…）定制色譜柱（期待與您合作，開發屬于您的專用柱）第32頁/共49頁

超高效液相色譜技術——

UHPLC色譜柱/Core-shell色譜柱第33頁/共49頁UHPLC色譜柱1.9μm粒徑：比1.7μm壓力低，耐污染耐壓800bar鍵合相：UHPASBC18UHPAQC18UHPC18第34頁/共49頁Bonshell填料技術

內部為1.7um實心球外部為0.5um多孔外殼耐污染:粒徑大同時物質不會進入硅膠實心球內部造成堵塞，較全多孔顆粒壽命更長。耐高壓:1.7um實心球較普通3um硅膠更高的耐壓性，耐壓到800bar(12000psi),為高流速分離提供支持。第35頁/共49頁填料粒徑對色譜柱柱效的影響第36頁/共49頁保持與1.9μm色譜柱相同分離速度和效果，卻維持較低的系統壓力第37頁/共49頁Bonshell-縮短了保留時間樣品:太古霉素5μm傳統C18,流速:1.0mL/min2.7μmBonshellASBC18流速:2.5mL/min第38頁/共49頁流動相:乙腈:1%甲酸=32:68UV:254nm流速:1.0mL/min.30°C進樣量:5μL響應時間:4.0秒響應時間:2.0秒響應時間:1.0秒響應時間:0.5秒響應時間:0.1秒尿嘧啶乙酰水楊酸N-乙酰苯胺UracilAcetylsalicylicacidAcetanilide縮短檢測器響應時間，可增加柱效（提高靈敏度）檢測器的響應時間對分離度的影響在UHPLC上值得重視第39頁/共49頁HPLC色譜柱的日常保養與維護

第40頁/共49頁新HPLC色譜柱的使用查看說明書，確定新色譜柱的保存溶劑(氨基柱，HILIC等)確定與檢測所需流動相是否互溶使用互溶溶劑過渡，正反相溶劑過渡使用異丙醇流動相含有鹽使用90%甲醇水過渡使用檢測流動相平衡色譜柱10-20倍柱體積色譜柱使用后的保存溶劑（正相建議同說明書，反相純乙腈或純甲醇）強烈建議進行色譜柱使用分類（由樣品類型來歸類）第41頁/共49頁色譜柱不銹鋼毛細管接頭如果伸出的管線長度過長，可能漏液

螺母坡度不匹配，密封性差

死體積區如果伸出的管線長度不夠，可能產生死體積第42頁/共49頁0.13mm內徑(紅)用于毛細管HPLC中<2.1內徑色譜柱0.18mm內徑(黃)用于分析型HPLC中2.1~4.6內徑色譜柱0.25mm內徑(藍)用于半制備型HPLC中10.0內徑色譜柱0.5mm內徑(橙)用于制備型HPLC中21.2內徑色譜柱PEEK連接管線與接頭色譜柱:4.6x30mm,3.5mm流動相:85%H2Owith0.1%三氟乙酸:15%ACN流速:1.0mL/min溫度:35°C50

mL柱外體積（管線）4321Time(min)0.00.51.01.52.010mL柱外體積Time(min)0.00.51.01.52.04321樣品:1.苯丙胺酸2.5-苯基-3,6-二氧-2-哌嗪乙酸3.Asp-Phe4.天冬甜素第43頁/共49頁色譜柱柱內體積和平衡時間

4.6x50 0.5mL 5min 4.6x150 1.5mL 15min 4.6x250 2.5mL 25min

2.1x30 0.06mL 3min 36sec 2.1x50 0.10mL 5min 60sec 2.1x100 0.20mL 10min 120sec

色譜柱 柱內平衡時間 尺寸 體積流速

(mm) (Vm)1.0mL/min

色譜柱 柱內平衡時間 尺寸 體積流速

(mm) (Vm)0.2mL/min1.0mL/min第44頁/共49頁顆粒物堵塞篩板引起柱壓上升顆粒物來源：樣品→離心，過0.45μm或0.22μm濾膜，注意濾膜性質泵和進樣閥密封圈磨損→更換配置流動相→過0.45μm或0.22μm濾膜，注意濾膜性質緩沖鹽析出→注意梯度運行和進樣時鹽的溶劑環境改變，甲醇對緩沖鹽溶