流式細胞術流式細胞術（FlowCytometry,簡稱FCM）是一個能夠快速、準確、客觀，而且同時檢測單個微粒（通常是細胞）多項特征技術，同時能夠對特定群體加以分選研究對象為生物顆粒，如各種細胞、染色體、微生物、及人工合成微球等研究微粒特征包含各種物理及生物學特征，并加以定量流式細胞術基本原理專家講座第1頁流式細胞儀特點單個細胞/生物顆粒分析同時多參數(shù)、多熒光分析高通量檢測/高速度10000個細胞/秒以上定性/定量分析分選特定性狀或功效細胞可檢測樣本種類多樣(1)外周血，骨髓，細針穿刺，洗脫液，實體組織，培養(yǎng)細胞(2)血清、血漿、培養(yǎng)上清、細胞裂解液流式細胞術基本原理專家講座第2頁當前流式細胞儀能夠檢測類別細菌浮游生物DM：0.2μm——15μm

單核細胞中性粒細胞淋巴細胞紅細胞流式細胞術基本原理專家講座第3頁流式細胞術基本原理專家講座第4頁流式細胞儀基本結構

激光發(fā)射器發(fā)出所需要波長激光前向散射光檢測器側向散射光檢測器光學濾鏡流動室與液流系統(tǒng)：將細胞單個壓入流動室信號搜集與數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)光源與光學系統(tǒng)流式細胞術基本原理專家講座第5頁InjectorTip熒光信號聚焦激光光束鞘液流動室流式細胞術基本原理專家講座第6頁當光子碰到濾片時，光子或經過濾片，或被濾片吸收，或被濾片反射。光學濾片流式細胞術基本原理專家講座第7頁光學濾片種類長通濾片（LP）：630LP短通濾片（SP）：550SP帶通濾片（BP）:488/10流式細胞術基本原理專家講座第8頁流式細胞術基本原理專家講座第9頁共有兩類：散射信號與熒光信號前向角散射信號（FSC） 反應細胞大小側向角散射信號（SSC） 反應細胞顆粒度熒光信號（FLSignals）（FL1、2、3……） 胞內、胞外染色情況流式細胞儀可獲取信號種類流式細胞術基本原理專家講座第10頁FSC和SSC直方圖流式細胞儀顯示圖種類流式細胞術基本原理專家講座第11頁把前向散射光圖和側向散射光圖一維圖像在二維圖像上投影，便是我們日常所看到流式圖。所以橫坐標表示是細胞直徑大小；縱坐標表示是細胞復雜程度。二者相結合就能說明細胞種類散點圖流式細胞術基本原理專家講座第12頁二維等高圖和密度圖流式細胞術基本原理專家講座第13頁假三維圖與三維圖Pseudo3DPlot3DPlot流式細胞術基本原理專家講座第14頁流式細胞儀怎樣獲取細胞信號？FSCSSCFL流式細胞術基本原理專家講座第15頁前向角信號（ForwardScatter，F(xiàn)SC）流式細胞術基本原理專家講座第16頁前向角信號：細胞大小流式細胞術基本原理專家講座第17頁FSCCountFSCCount101000流式細胞術基本原理專家講座第18頁側向角信號（SideScatter，SSC）流式細胞術基本原理專家講座第19頁SSCCountSSCCount101000流式細胞術基本原理專家講座第20頁FL流式細胞術基本原理專家講座第21頁countFL流式細胞術基本原理專家講座第22頁FSC、SSC、FL流式細胞術基本原理專家講座第23頁怎樣分離90°角內各種熒光信號？流式細胞術基本原理專家講座第24頁熒光染料吸收某一波長光波后能發(fā)射出大于吸收光波長光波物質激發(fā)光PI488n>600nm流式細胞術基本原理專家講座第25頁熒光染料種類熒光染料激發(fā)波長(nm)發(fā)射波長(nm)用途顏色FITC488525免疫熒光綠色PE(RD1)488575免疫熒光橙色

PerCP 488 670免疫熒光

紅色PI488620DNA染色

橙紅ECD488620免疫熒光橙紅PeCy5488675免疫熒光

紅色APC633 670免疫熒光紅色DAPI359462DNA染色藍色流式細胞術基本原理專家講座第26頁熒光染料光譜特征流式細胞術基本原理專家講座第27頁熒光分離標準在流式細胞儀中，普通經過LP或SP濾片將熒光大致分開后，再經過一BP濾片分離出特征熒光流式細胞術基本原理專家講座第28頁開放式光路Calibur、Influx流式細胞儀光路流式細胞術基本原理專家講座第29頁封閉式光路（CantoⅡ、LSR系列、Aria系列）流式細胞術基本原理專家講座第30頁分選將目標細胞分離并富集，進行后續(xù)研究。分選純度>99%流式細胞術基本原理專家講座第31頁震蕩激光流式細胞術基本原理專家講座第32頁偏轉板FluorescenceActivatedCellSorting488

nm

laser+-ChargedPlatesSinglecellssortedintotesttubesFALSSensorFluorescencedetector流式細胞術基本原理專家講座第33頁幾個概念信號放大模式信號類型CV值樣本流速激光延遲液滴延遲熒光賠償閾值門對照流式細胞術基本原理專家講座第34頁信號放大PMT將光信號轉換成電信號，調整PMT電壓，信號強度將隨之改變光信號光電倍增管（PMT）放大器電信號放大器兩種放大方式：線性放大（lin）對數(shù)放大（log）流式細胞術基本原理專家講座第35頁線性放大（lin）按光強度線性關系輸出信號.適合用于在較小范圍內改變信號以及代表生物過程信號，如DNA含量、總蛋白含量等。流式細胞術基本原理專家講座第36頁對數(shù)放大（log）按光強度對數(shù)關系輸出信號.在免疫學測量中通常使用對數(shù)放大。流式細胞術基本原理專家講座第37頁電脈沖信號類型將與電脈沖信號強弱相關電壓數(shù)字化有三類電脈沖信號高度信號H面積信號A寬度信號W流式細胞術基本原理專家講座第38頁CV值CV值（變異系數(shù)）：樣品均一度及儀器分辨率標志CV值普通<2%流式細胞術基本原理專家講座第39頁樣本流速流式細胞術基本原理專家講座第40頁高流速：普通用于定性分析，如免疫分型。采集速度快,但分辨率低.低流速：普通用于對分辨率要求較高分析，如DNA分析。樣本流速選擇流式細胞術基本原理專家講座第41頁激光延遲（laserdelay）Laser1Laser2流式細胞術基本原理專家講座第42頁液滴延遲（dropdelay）流式細胞術基本原理專家講座第43頁顏色賠償采取適當方法校正熒光染料之間疊加所造成誤差。在完成雙色以上熒光標識樣本時，都需要作顏色賠償。流式細胞術基本原理專家講座第44頁FITC主要由FITC檢測器檢測，但部分光也會進入PE檢測器。假如單染FITC，同時打開PE檢測器，則如圖：理想狀態(tài)實際情況賠償效果陰性對照流式細胞術基本原理專家講座第45頁閾值

信號放大過程會產生不需要脈沖信號，通常來自于碎片。經過設定某一信號最低強度值，可將不需要脈沖信號去除，這一設定值稱為閾值。屏蔽噪音信號和碎片信號流式細胞術基本原理專家講座第46頁門（Gate）分析/分選感興趣細胞群流式細胞術基本原理專家講座第47頁對照同型對照：為沒有特異性、與熒光抗體蛋白亞型一致免疫球蛋白，通常是未進行免疫小鼠血清純化Ig