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文檔簡介

實驗五小鼠脾單個核細胞的分離

—密度梯度離心法

實驗五小鼠脾單個核細胞的分離

原理：

根據物理學顆粒沉降原理，不同密度的顆粒在其沉降運動中可因其比重的差別而處于不同的分布位置。利用此原理可設計一定比重的液體界面，將小鼠脾臟中各種不同比重的細胞通過離心沉降而達到使其彼此分離的目的。原理：原理：

已知小鼠淋巴細胞和單核細胞的比重為1.088左右，而紅細胞與粒細胞的比重均大于1.088。因此，若用比重為1.088±0.001的分離液則可通過密度梯度離心方法，在分離液界面上收集得到脾單個核細胞。原理：操作步驟：將2ml小鼠脾臟細胞懸液混勻，然后用滴管沿盛有2ml淋巴細胞分離液的試管壁輕輕鋪于分離液面上。將該試管置水平式離心機中1800rpm離心15min。用滴管小心直接插入白色絮狀的細胞層，吸出界面層細胞，移入另一試管中。操作步驟：將2ml小鼠脾臟細胞懸液混勻，然后用滴管沿盛有2m操作步驟：離心后的樣本各成份在試管中的分布位置如下圖：1.0881.088操作步驟：離心后的樣本各成份在試管中的分布位置如下圖：1.0操作步驟：加入足量生理鹽水，用滴管輕輕上下混勻，然后1000rpm離心10min，棄去上清液，將沉淀細胞充分搖勻，然后用生理鹽水再離心洗滌1次，棄去上清液后充分搖勻沉淀細胞。用生理鹽水稀釋沉淀細胞至0.3ml（約加6滴），混勻。取細胞懸液一滴加入等量白細胞稀釋液于另一試管中充分混勻，用計數板在顯微鏡下計數，計算出淋巴細胞濃度（個/ml）。檢查細胞活力：取細胞懸液一滴，加入等量錐蘭溶液于另一試管中，充分混勻后立即滴一滴細胞懸液于載玻片上，在顯微鏡下計數100~200個淋巴細胞中著色的死細胞數。操作步驟：加入足量生理鹽水，用滴管輕輕上下混勻，然后1000操作注意事項注意分離液與稀釋血的比例，一般以1:2~1:3為宜。分離時所取的離心速度與時間，因各臺離心機的離心半徑而異，需事先通過預試驗決定。加入稀釋血時應十分小心，注意保護試管內的界面，勿使混淆影響分離效果。做細胞活力檢查時，錐蘭染色后應盡快計數完畢，時間過長則細胞活力可能降低。操作注意事項注意分離液與稀釋血的比例，一般以1:2~1:3實驗結果記錄與分析通過前后兩次細胞計數：實驗結果記錄與分析通過前后兩次細胞計數：單個核細胞濃度（個/ml）

四大方格細胞總數×10×2×1034

一大方格=1×

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