新型雙配體苯磺酸混合模式固定相的合成及應(yīng)用

隨著新藥物的開發(fā)，藥物分子呈現(xiàn)多樣性的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。據(jù)統(tǒng)計,48.6%的生物活性藥物保持中性形式,51.4%的藥物以鹽的形式存在,其中包括38.6%的堿性藥物和12.8%的酸性藥物混合模式色譜(MMC)的發(fā)展解決了單一模式色譜分離容量受限的難題,通過固定相表面不同功能基團與溶質(zhì)的多種相互作用,可用于不同色譜模式分離或不同類型化合物的同時分離強陽離子交換色譜作為混合模式色譜中最重要的保留模式之一,能夠提供獨特的保留機制和選擇性,已廣泛用于金屬離子本文通過巰基-烯點擊化學(xué)方法,在硅膠表面鍵合巰基的基礎(chǔ)上,對其進行苯磺酸和苯基的表面改性,制備RP/HILIC/SCX混合模式色譜固定相。采用元素分析和1實驗部分1.1相色譜分析和材料VarianInfinityPlus-300MHz固體核磁共振譜儀(美國PaloAlto公司);VarioMicroCube元素分析儀(德國Elementar公司);安捷倫1100高效液相色譜分析儀(美國安捷倫公司);球形硅膠(9.8μm,292m巰丙基三甲氧基硅烷(MPTMS,湖北武大有機硅新材料股份有限公司);對苯乙烯磺酸鈉(上海源葉生物科技有限公司);苯乙烯、三乙胺(TEA)、偶氮二異丁腈(AIBN)、乙苯、丙苯、丁苯、戊苯、1-萘胺、對苯二胺、三聚氰胺(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所);甲苯、對硝基苯胺、對氯苯胺、苯胺(天津市江天化工技術(shù)有限公司);雙氰胺、鹽酸二甲雙胍、尿嘧啶、尿苷、腺苷、腺嘌呤、胞嘧啶(上海麥克林生化科技有限公司);對乙酰氨基酚、布洛芬、替硝唑、吲哚美辛、硫酸沙丁胺醇、鹽酸普魯卡因胺、鹽酸可樂定標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所)。1.2苯磺酸修飾單配體固定相的制備稱取4g活化的SiO將4gMPS微球和80mL甲醇分散于150mL反應(yīng)瓶中,然后加入0.04g(0.24mmol)AIBN、0.165g(0.8mmol)對苯乙烯磺酸鈉(SS)和184μL(1.6mmol)苯乙烯(St),連續(xù)振蕩溶解后通氮氣除氧,用四氟帶密封,置于70℃恒溫水浴搖床中振搖12h,依次用甲醇、乙醇-水(1∶1)、甲醇洗滌后,80℃下減壓干燥過夜,得到苯基-苯磺酸基雙配體混合模式固定相(Phenyl/Benzenesulfonatephase,Ph/BS)。與上述合成途徑相同,反應(yīng)過程不加St,得到苯磺酸修飾的單配體固定相(Benzenesulfonatephase,BS)作對照。將Ph/BS填料和BS填料裝入不銹鋼柱管(150mm×4.6mmi.d.)得到色譜分析柱。1.3親水評價體系反相評價體系:分離苯同系物:流動相為甲醇-水(60∶40,體積比),檢測波長為254nm。親水評價體系和兩親性保留機理研究:分離核苷及堿基類化合物,流動相為乙腈-20mmol/L乙酸銨,檢測波長為254nm。離子交換評價體系:分離含氮堿性化合物,流動相為乙腈-60mmol/LKH1.4應(yīng)用分離雙氰胺、三聚氰胺和二甲雙胍:流動相為1.7%NH分離酸性、中性和堿性藥物:流動相為乙腈-60mmol/LKH2結(jié)果與討論2.1鍵合硅膠的元素含量Ph/BS固定相的表面結(jié)構(gòu)通過通過元素分析對固定相進行定量表征。巰丙基鍵合硅膠(MPS)的元素含量分別為:C3.88%,S2.42%,根據(jù)式(1)計算得到巰丙基鍵合量為4.23μmol/m計算得到Ph/BS固定相上苯磺酸和苯基的鍵合量分別為0.48、0.98μmol/m2.2流動相中水含量的影響采用一系列烷基苯同系物評價了Ph/BS固定相的疏水性和亞甲基選擇性,在相同的色譜條件下,烷基苯同系物在BS和Ph/BS兩個固定相上均得到較好的保留和分離(圖2),但在雙配體Ph/BS固定相上的保留和分離度明顯增加,原因是疏水性苯基增加了固定相的反相作用和π-π相互作用。考察了流動相中水含量(35%、40%、45%、50%)對Ph/BS固定相上烷基苯同系物保留因子的影響,結(jié)果顯示溶質(zhì)的保留隨流動相中水相比例的增加而顯著增加,進一步證明了Ph/BS固定相的反相色譜行為。以保留因子的對數(shù)與烷基苯側(cè)鏈上的亞甲基數(shù)目作圖,兩者在不同流動相條件下均呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系(見圖3),說明Ph/BS固定相具有較好的亞甲基選擇性。極性磺酸基的存在使得Ph/BS固定相可用于親水色譜模式上述結(jié)果表明,由于Ph/BS固定相表面含有親水基團(—SO在酸性條件下,對硝基苯胺、對氯苯胺、1-萘胺、苯胺、三聚氰胺和鄰苯二胺6種胺類小分子化合物解離帶正電荷,可用于評價Ph/BS固定相的離子交換行為。在乙腈-60mmol/LKH2.3回復(fù)合成巖原料雜質(zhì)雙氰胺和雙氰胺的分離二甲雙胍是一種降血糖藥物,常用于Ⅱ型糖尿病的治療。雙氰胺和三聚氰胺作為其反應(yīng)中間體,具有一定毒性,必須進行嚴(yán)格控制以確保用藥安全有效。在“1.4”條件下,Ph/BS固定相能夠很好地分離二甲雙胍和原料雜質(zhì)雙氰胺(圖6),且三聚氰胺與二甲雙胍的分離度為11.4,滿足藥典規(guī)定的分離度大于10.0的要求。另外,三聚氰胺和二甲雙胍的峰形對稱,理論塔板數(shù)分別為30013和24080,相比于藥典分析方法(15000/m)的柱效更高,因此,Ph/BS固定相可在SCX模式下用于二甲雙胍制劑的質(zhì)量檢測和控制。3rp/scx混合模式本文制備并表征了雙配體苯磺酸混合模式固定相。采用多種測試體系對Ph/BS固定相進行色譜性能評價,發(fā)現(xiàn)其分離過程涉及疏水作用、π-π作用、極性作用和陽離子交換等多種作用形式,對核苷類小分子的保留體現(xiàn)了RP/HILIC雙重保留機理。相比于單配體BS固定相,在保證相同極性的條件下,Ph/BS固定相可添加疏水苯基來增加反相保留行為,說明該方法可靈活調(diào)節(jié)各功能配體的比例,以滿足不同的分離要求。該混合模式固定相在SCX模式下用于二甲雙胍及其雜質(zhì)的高效分離分析,效果優(yōu)于藥典方法;在RP/SCX混合模式下可實現(xiàn)酸性、中性和堿性藥物的同時分離。研究結(jié)果表明,所制備的固定相在復(fù)雜體系的分離分析方面具有潛在的應(yīng)用價值。其中,S2.2.1相評估的再評價2.2.2親水評估2.2.3親水保持機制2.2.4離子交換率2.3.2在ph和bs固定相上的分離由于Ph/BS固定相具有RP/SCX性質(zhì),可用于中性和離子型藥物的同時分離。在“1.4”條件下,中性(對乙酰氨基酚、替硝唑)、酸性(布洛芬:pKa5.2;吲哚美辛:pKa4.5)和堿性藥物(沙丁胺醇:pKa9.3;普魯卡因胺:pKa9.2;可樂定:pKa8.05)在Ph/BS固定相上均得到較好的分離(圖7)。在pH3.0條件下,布洛芬和吲哚美辛不解離,因此與磺酸基所帶負(fù)電荷不存在離子排斥作用,從而在固定相上保留。中性和酸性藥物在Ph/BS固定相上的保留依靠疏水相互作用,lg