新型雙配體苯磺酸混合模式固定相的合成及應(yīng)用

隨著新藥物的開發(fā)，藥物分子呈現(xiàn)多樣性的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。據(jù)統(tǒng)計(jì),48.6%的生物活性藥物保持中性形式,51.4%的藥物以鹽的形式存在,其中包括38.6%的堿性藥物和12.8%的酸性藥物混合模式色譜(MMC)的發(fā)展解決了單一模式色譜分離容量受限的難題,通過固定相表面不同功能基團(tuán)與溶質(zhì)的多種相互作用,可用于不同色譜模式分離或不同類型化合物的同時(shí)分離強(qiáng)陽離子交換色譜作為混合模式色譜中最重要的保留模式之一,能夠提供獨(dú)特的保留機(jī)制和選擇性,已廣泛用于金屬離子本文通過巰基-烯點(diǎn)擊化學(xué)方法,在硅膠表面鍵合巰基的基礎(chǔ)上,對(duì)其進(jìn)行苯磺酸和苯基的表面改性,制備RP/HILIC/SCX混合模式色譜固定相。采用元素分析和1實(shí)驗(yàn)部分1.1相色譜分析和材料VarianInfinityPlus-300MHz固體核磁共振譜儀(美國(guó)PaloAlto公司);VarioMicroCube元素分析儀(德國(guó)Elementar公司);安捷倫1100高效液相色譜分析儀(美國(guó)安捷倫公司);球形硅膠(9.8μm,292m巰丙基三甲氧基硅烷(MPTMS,湖北武大有機(jī)硅新材料股份有限公司);對(duì)苯乙烯磺酸鈉(上海源葉生物科技有限公司);苯乙烯、三乙胺(TEA)、偶氮二異丁腈(AIBN)、乙苯、丙苯、丁苯、戊苯、1-萘胺、對(duì)苯二胺、三聚氰胺(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所);甲苯、對(duì)硝基苯胺、對(duì)氯苯胺、苯胺(天津市江天化工技術(shù)有限公司);雙氰胺、鹽酸二甲雙胍、尿嘧啶、尿苷、腺苷、腺嘌呤、胞嘧啶(上海麥克林生化科技有限公司);對(duì)乙酰氨基酚、布洛芬、替硝唑、吲哚美辛、硫酸沙丁胺醇、鹽酸普魯卡因胺、鹽酸可樂定標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)。1.2苯磺酸修飾單配體固定相的制備稱取4g活化的SiO將4gMPS微球和80mL甲醇分散于150mL反應(yīng)瓶中,然后加入0.04g(0.24mmol)AIBN、0.165g(0.8mmol)對(duì)苯乙烯磺酸鈉(SS)和184μL(1.6mmol)苯乙烯(St),連續(xù)振蕩溶解后通氮?dú)獬?用四氟帶密封,置于70℃恒溫水浴搖床中振搖12h,依次用甲醇、乙醇-水(1∶1)、甲醇洗滌后,80℃下減壓干燥過夜,得到苯基-苯磺酸基雙配體混合模式固定相(Phenyl/Benzenesulfonatephase,Ph/BS)。與上述合成途徑相同,反應(yīng)過程不加St,得到苯磺酸修飾的單配體固定相(Benzenesulfonatephase,BS)作對(duì)照。將Ph/BS填料和BS填料裝入不銹鋼柱管(150mm×4.6mmi.d.)得到色譜分析柱。1.3親水評(píng)價(jià)體系反相評(píng)價(jià)體系:分離苯同系物:流動(dòng)相為甲醇-水(60∶40,體積比),檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm。親水評(píng)價(jià)體系和兩親性保留機(jī)理研究:分離核苷及堿基類化合物,流動(dòng)相為乙腈-20mmol/L乙酸銨,檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm。離子交換評(píng)價(jià)體系:分離含氮堿性化合物,流動(dòng)相為乙腈-60mmol/LKH1.4應(yīng)用分離雙氰胺、三聚氰胺和二甲雙胍:流動(dòng)相為1.7%NH分離酸性、中性和堿性藥物:流動(dòng)相為乙腈-60mmol/LKH2結(jié)果與討論2.1鍵合硅膠的元素含量Ph/BS固定相的表面結(jié)構(gòu)通過通過元素分析對(duì)固定相進(jìn)行定量表征。巰丙基鍵合硅膠(MPS)的元素含量分別為:C3.88%,S2.42%,根據(jù)式(1)計(jì)算得到巰丙基鍵合量為4.23μmol/m計(jì)算得到Ph/BS固定相上苯磺酸和苯基的鍵合量分別為0.48、0.98μmol/m2.2流動(dòng)相中水含量的影響采用一系列烷基苯同系物評(píng)價(jià)了Ph/BS固定相的疏水性和亞甲基選擇性,在相同的色譜條件下,烷基苯同系物在BS和Ph/BS兩個(gè)固定相上均得到較好的保留和分離(圖2),但在雙配體Ph/BS固定相上的保留和分離度明顯增加,原因是疏水性苯基增加了固定相的反相作用和π-π相互作用。考察了流動(dòng)相中水含量(35%、40%、45%、50%)對(duì)Ph/BS固定相上烷基苯同系物保留因子的影響,結(jié)果顯示溶質(zhì)的保留隨流動(dòng)相中水相比例的增加而顯著增加,進(jìn)一步證明了Ph/BS固定相的反相色譜行為。以保留因子的對(duì)數(shù)與烷基苯側(cè)鏈上的亞甲基數(shù)目作圖,兩者在不同流動(dòng)相條件下均呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系(見圖3),說明Ph/BS固定相具有較好的亞甲基選擇性。極性磺酸基的存在使得Ph/BS固定相可用于親水色譜模式上述結(jié)果表明,由于Ph/BS固定相表面含有親水基團(tuán)(—SO在酸性條件下,對(duì)硝基苯胺、對(duì)氯苯胺、1-萘胺、苯胺、三聚氰胺和鄰苯二胺6種胺類小分子化合物解離帶正電荷,可用于評(píng)價(jià)Ph/BS固定相的離子交換行為。在乙腈-60mmol/LKH2.3回復(fù)合成巖原料雜質(zhì)雙氰胺和雙氰胺的分離二甲雙胍是一種降血糖藥物,常用于Ⅱ型糖尿病的治療。雙氰胺和三聚氰胺作為其反應(yīng)中間體,具有一定毒性,必須進(jìn)行嚴(yán)格控制以確保用藥安全有效。在“1.4”條件下,Ph/BS固定相能夠很好地分離二甲雙胍和原料雜質(zhì)雙氰胺(圖6),且三聚氰胺與二甲雙胍的分離度為11.4,滿足藥典規(guī)定的分離度大于10.0的要求。另外,三聚氰胺和二甲雙胍的峰形對(duì)稱,理論塔板數(shù)分別為30013和24080,相比于藥典分析方法(15000/m)的柱效更高,因此,Ph/BS固定相可在SCX模式下用于二甲雙胍制劑的質(zhì)量檢測(cè)和控制。3rp/scx混合模式本文制備并表征了雙配體苯磺酸混合模式固定相。采用多種測(cè)試體系對(duì)Ph/BS固定相進(jìn)行色譜性能評(píng)價(jià),發(fā)現(xiàn)其分離過程涉及疏水作用、π-π作用、極性作用和陽離子交換等多種作用形式,對(duì)核苷類小分子的保留體現(xiàn)了RP/HILIC雙重保留機(jī)理。相比于單配體BS固定相,在保證相同極性的條件下,Ph/BS固定相可添加疏水苯基來增加反相保留行為,說明該方法可靈活調(diào)節(jié)各功能配體的比例,以滿足不同的分離要求。該混合模式固定相在SCX模式下用于二甲雙胍及其雜質(zhì)的高效分離分析,效果優(yōu)于藥典方法;在RP/SCX混合模式下可實(shí)現(xiàn)酸性、中性和堿性藥物的同時(shí)分離。研究結(jié)果表明,所制備的固定相在復(fù)雜體系的分離分析方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。其中,S2.2.1相評(píng)估的再評(píng)價(jià)2.2.2親水評(píng)估2.2.3親水保持機(jī)制2.2.4離子交換率2.3.2在ph和bs固定相上的分離由于Ph/BS固定相具有RP/SCX性質(zhì),可用于中性和離子型藥物的同時(shí)分離。在“1.4”條件下,中性(對(duì)乙酰氨基酚、替硝唑)、酸性(布洛芬:pKa5.2;吲哚美辛:pKa4.5)和堿性藥物(沙丁胺醇:pKa9.3;普魯卡因胺:pKa9.2;可樂定:pKa8.05)在Ph/BS固定相上均得到較好的分離(圖7)。在pH3.0條件下,布洛芬和吲哚美辛不解離,因此與磺酸基所帶負(fù)電荷不存在離子排斥作用,從而在固定相上保留。中性和酸性藥物在Ph/BS固定相上的保留依靠疏水相互作用,lg