高通量測序技術姓名：趙淑莉學校：吉林大學高通量測序技術姓名：趙淑莉主要內容類型及原理2應用341概述致謝主要內容類型及原理2應用341概概述高通量測序技術(High-throughputsequencing)

又稱“下一代”測序技術”、深度測序

以能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定和一般讀長較短等為標志。

這使得對一個物種的轉錄組和基因組進行細致全貌的分析成為可能。概述高通量測序技術(High-throughput類型及原理

目前，所說的高通量測序技術主要是指454LifeSciences公司、ABI

公司和Illumina公司推出的第二代測序技術以及HelicosHeliscopeTM和PacificBiosciences

推出的單分子測序技術。類型及原理目前，所說的高通量測序技術主要是指42005年，454LifeSciences公司(現已被Roche公司收購)首先推出了革命性的基于焦磷酸測序法的超高通量基因組測序系統，開創了第二代測序技術的先河。第二代測序技術2005年，454LifeScience原理：酶級聯化學發光反應1.首先將PCR

擴增的單鏈DNA與引物雜交，并與DNA

聚合酶、ATP

硫酸化酶、熒光素酶、三磷酸腺苷雙磷酸酶、底物熒光素酶和5'-磷酸硫酸腺苷共同孵育。第二代測序技術2.在每一輪測序反應中只加入一種dNTP，若該dNTP與模板配對，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數的焦磷酸。原理：酶級聯化學發光反應第二代測序技術2.在每一輪測序反應中原理：酶級聯化學發光反應3.焦磷酸鹽被硫酸化酶轉化為ATP，ATP

就會促使氧合熒光素的合成并釋放可見光，CCD檢測后通過軟件轉化為一個峰值，峰值與反應中摻入的核苷酸數目成正比。第二代測序技術原理：酶級聯化學發光反應第二代測序技術此后，Illumina

公司和ABI公司相繼推出了Solexa和SOLiD(supportedoligoligationdetetion)測序技術。第二代測序技術此后，Illumina公司和ABI公司相繼推出了Sole

即生成新DNA

互補鏈時，要么加入的dNTP通過酶促級聯反應催化底物激發出熒光，要么直接加入被熒光標記的dNTP

或半簡并引物，在合成或連接生成互補鏈時釋放出熒光信號。通過捕獲光信號并轉化為一個測序峰值，獲得互補鏈序列信息。原理：與焦磷酸測序法的類似，核心思想都是邊合成邊測序(sequencingbysynthesis)。第二代測序技術即生成新DNA互補鏈時，要么加入的dNTP第二代測序技術優點：操作極為簡便：無需進行電泳；可以在芯片上進行高通量分析；大大節省了成本和時間。第二代測序技術優點：Illumina公司目前擁有三種測序平臺，分別為HiSeq2000、HiSeq1000、GenomeAnalyzerIIx(/)；ABI公司則主要是SOLiD3

和SOLiD4兩個測序平臺。

從通量這個最直觀的數字看來，HiSeq2000領先于SOLiD4。

HiSeq2000測序平臺單次反應可以讀取200G的數據，而SOLiD4

僅為100G

左右。第二代測序技術Illumina公司目前擁有三種測序平臺，分別

就測序讀長來說，454

測序平臺讀長最長，目前已經達到400nt。因此，454

平臺比較適合對未知基因組從頭測序，但是在判斷連續單堿基重復區時準確度不高。Solexa

測序讀長較454短，僅為100nt

左右，但測序通量高、價位低，適合基因組重測序等。SOLiD讀長也較短，但測序精度較高，特別適合SNP檢測等。就測序讀長來說，454測序平臺讀長最長，目前在第二代測序平臺不斷完善和廣泛應用的同時，以對單分子DNA進行非PCR測序為主要特征的更新的測序技術也初顯端倪。2008年4月HelicoBioScience公司的Harris等在Science上報道了他們開發的基于全內反射顯微鏡(totalInternalreflectionmicroscopy,TIRM)的測序技術—單分子測序技術。單分子測序技術在第二代測序平臺不斷完善和廣泛應用的同時，以對單分子DNA進基于全內反射顯微鏡(totalInternalreflectionmicroscopy,TIRM)的測序技術原理：1.將待測DNA樣品隨機打斷成小片段，在每個小片段的末端加上poly-dA；2.將小片段DNA模板與固定在檢測芯片上的poly-dT引物進行雜交并精確定位，并逐一加入熒光標記的末端終止子；單分子測序技術基于全內反射顯微鏡(totalInternalrefle3.洗滌、成像，切開熒光染料和抑制基團；4.洗滌、加帽，允許下一個核苷酸的摻入；5.這樣通過摻入、檢測和切除的反復循環，即可實時讀取大量序列。3.洗滌、成像，切開熒光染料和抑制基團；單分子實時技術(SMRT)單分子測序技術

該技術利用單分子技術和DNA聚合酶，在聚合反應的同時就可以讀取測序產物。SMRT測序技術在測序速度、讀長和成本方面有著巨大的優勢和潛力。單分子實時技術(SMRT)單分子測序技術該技IonPGM測序技術原理

基于半導體芯片技術，在半導體芯片的微孔中固定DNA鏈，隨后依次摻入ACGT，隨著每個堿基的摻入，釋放出氫離子，在它們穿過每個孔底部時能被檢測到。單分子測序技術IonPGM測序技術單分子測序技術主要優點：大大節省了成本和時間主要缺點：測序儀的價格昂貴單分子測序技術主要優點：單分子測序技術

目前HelicoBioScience公司的HeliScope測序儀售價近百萬美元，這是一般實驗室和科研單位所不能承受的。LifeTechologies公司推出的IonPersonalGenomeMachine(PGMTM)測序儀價格僅為普通測序儀的1/10，而且研究人員能夠在2h內獲取從10Mb到1Gb以上高精確度序列。單分子測序技術目前HelicoBioScience公司的H大規模平行測序(massivelyparallelsignaturesequencing，MPSS)：它利用芯片進行測序，可以在數百萬個點上同時閱讀測序，把平行處理的思想用到極致。高通量測序技術的優點成本低廉：利用高通量測序技術進行人類基因組測序，耗資不到傳統測序法的1%。大規模平行測序(massivelyparallelsig高通量測序技術的優點高通量測序技術有完美的定量功能：這是因為樣品中某種DNA被測序的次數反映了樣品中這種DNA的豐度。這一點有望取代以前的基因表達芯片技術用于基因表達的研究。高通量測序技術的優點高通量測序技術有完美的定量功能：這是因為高通量測序技術的應用大規模基因組測序基因表達分析非編碼小分子RNA的鑒定轉錄因子靶基因的篩選DNA甲基化相關研究其他高通量測序技術的應用大規模基因組測序全基因組測序

高通量測序技術在發展初期由于讀長較短，使其在對未知基因組從頭測序(denovoSequencing)的應用受到限制，只能用于基因組重測序。基因組重測序是指對已知基因組序列的物種進行不同個體的基因組測序，并在此基礎上對個體或群體進行差異性分析。全基因組測序高通量測序技術在發展初期由于讀長高通量RNA測序及其在轉錄組和基因表達調控上的應用

最近科學家們將高通量測序技術應用于轉錄組分析開發出了RNA測序技術(RNA-Seq)，該技術能夠在全基因組范圍內檢測基因表達情況，進行差異基因篩選分析。

由于RNA-Seq技術具有通量高、可重復性高、檢測范圍寬、定量準等特點，已經廣泛應用于細菌、擬南芥、水稻和人類等生物轉錄組的研究。高通量RNA測序及其在轉錄組和基因表達調控上的應用

轉錄組研究是從整體水平研究基因功能以及基因結構。但是，多數研究人員感興趣的是某一特定的生物過程、發育階段或處理后的基因表達情況。

建立在高通量測序基礎上的數字化基因表達譜(digitalgeneexpressionprofiling)分析無需預先針對已知序列設計探針，即可對任何生物整體轉錄活動進行檢測，因此應用范圍更加廣泛。轉錄組研究是從整體水平研究基因功能以及基因結構

高通量RNA

測序技術另一個廣泛應用的領域是小RNA的研究。

小RNA在植物的生長、發育和外界脅迫應答等方面具有重要功能。

但由于小RNA序列短、同源性高，因此利用基因芯片檢測小RNA非常困難。

高通量測序技術不但能夠克服這一難題，而且能夠發現新的小RNA。目前，高通量測序技術已經成功的應用于擬南芥、水稻和小麥等生物小RNA的研究。高通量RNA測序技術另一個廣泛應用的領域是小

ChIP-Seq

技術及其在DNA和蛋白質相互作用研究中的應用

染色質免疫共沉淀(chromatinimmuno-precipitation，ChIP)

技術是研究體內蛋白質與DNA

之間相互作用的強有力工具，在轉錄因子結合位點或組蛋白特異性修飾位點的研究中被廣泛應用。ChIP-Seq技術及其在DNA和蛋白質相互作用研究

染色質免疫共沉淀測序(chromatinimmuneprecipitationsequencing，ChIP-Seq)技術充

分結合了ChIP和高通量測序技術的優勢，能夠在全基因組范圍內高效地研究目的蛋白的結合位點。染色質免疫共沉淀測序(chromatini該技術的原理：1.通過ChIP技術利用抗體特異性地富集交聯的目的蛋白-DNA復合體；2.將得到的DNA片段進行高通量測序；3.將獲得的數百萬條序列標簽精確定位到基因組上，從而獲得全基因組范圍內與組蛋白或轉錄因子等互作的DNA區段信息。該技術的原理：基因組DNA甲基化分析DNA甲基化在維持細胞正常功能、遺傳印記和胚胎發育過程中起著極其重要的作用。

新一代高通量測序技術使得基因組整體水平高精度的甲基化檢測成為現實。

目前，高通量測序技術已經廣泛應用于擬南芥、水稻、蠶和人等生物DNA甲基化的研究，并取得了豐碩的成果。基因組DNA甲基化分析DNA甲基化在維持細

目前，已經建立了至少三種依賴于高通量測序的DNA甲基化分析技術：甲基化DNA免疫共沉淀測序(methylatedDNAimmunoprecipitationsequencing，MeDIP-Seq)；甲基結合蛋白測序(methyl-bindingproteinsequencing，MBD-Seq)；亞硫酸氫鹽測序(bisulfite-sequencing，BS-Seq)。目前，已經建立了至少三種依賴于高通量測序的DNMeDIP-Seq和MBD-Seq首先通過特異性結合甲基化DNA的MBD2b

或5‘-甲基胞嘧啶抗體富集高甲基化的DNA，然后再對富集到的片段測