新分子檢測技術在肺癌精準治療中的應用NGS與ddPCR比較新分子檢測技術在肺癌精準治療中的應用1LiTH,etal.JClinOncol31:1039-1049測序技術的發展帶來靶向治療的縱深研究LiTH,etal.JClinOncol31:2PCR技術也經歷了3代的進化PCR技術也經歷了3代的進化31987年，KRAS基因突變在當時50%的肺腺癌患者中被發現。2004年，EGFR突變作為新的肺腺癌驅動基因被發現。2014年，隨著TCGA計劃的完成，肺腺癌的基因突變圖譜被進一步完善。對NSCLC驅動基因的認知隨著分子檢測技術的進步在不斷深入

AshleyJ.Vargasetal，NatureReviewsCancer16,525–537(2016)1987年，KRAS基因突變在當時50%的肺腺癌患者中被發現4遺傳易感性早期篩查伴隨診斷用藥指導復發與疾病進展監控血液組織良惡性判斷NGS在腫瘤臨床領域的應用遺傳易感性早期篩查伴隨診斷用藥指導復發與疾病進展監控血液組織5遺傳易感性早期篩查伴隨診斷用藥指導復發與疾病進展監控良惡性或分子分型非小細胞肺癌NGS在肺癌臨床領域的應用NGS+ddPCRNGS+ddPCRNGS遺傳易感性早期篩查伴隨診斷用藥指導復發與疾病進展監控良惡性或6腫瘤的異質性對傳統分子組織診斷提出了挑戰腫瘤的異質性對傳統分子組織診斷提出了挑戰7NGS和ddPCR都是通過計算，看檢測出多少帶有突變的DNA（突變型），和檢測到的所有的DNA（野生型+突變型）的比值來確定等位基因突變頻率（AF）。等位基因突變頻率=4/14=28.5%未突變的DNA來自正常組織或腫瘤中的其他亞克隆NGS和ddPCR都能夠報告等位基因突變頻率，反映不同亞克隆的比例關系EGFRL858通過等位基因突變頻率在結合樣本病理評估中的腫瘤細胞占比，我們能夠對腫瘤內部帶有不同驅動基因的腫瘤細胞亞克隆有一個大致的比例上的了解。對了解腫瘤異質性有幫助。NGS和ddPCR都是通過計算，看檢測出多少帶有突變的DNA8NGS和ddPCR都可分辨分子順式/分子反式K.S.Thress,etal.NatMed,2015.21(6):p.560-562.有研究發現T790M和C797S突變分子順式/分子反式信息影響EGFRTKI治療療效；NGS和ddPCR都能夠提供EGFR突變的incis/intran信息，具有重要的臨床意義，傳統PCR檢測則會遺漏這一信息；NGS和ddPCR都可分辨分子順式/分子反式K.S.Thr9基于靶向捕獲的NGS能夠同時檢測已知突變和未知突變ddPCRCaptureNGS熱點1熱點2熱點3熱點4檢測基因基于靶向捕獲的NGS能夠同時檢測已知突變和未知突變ddPCR10NCCN指南建議初診患者進行多靶點平行檢測NCCN指南建議初診患者進行多靶點平行檢測11針對非小細胞肺癌的8個基因NGS可以完全覆蓋NGS與ddPCR在肺癌8基因檢測對比檢測基因型NGS組織NGS血液ddPCR組織ddPCR血液EGFR突變檢測已知+未知檢測已知+未知已知已知ALK融合檢測已知+未知檢測已知+未知已知難（已知）HER2突變檢測已知+未知檢測已知+未知已知已知BRAF突變檢測已知+未知檢測已知+未知已知已知MET擴增可以難很好好MET14外顯子跳讀檢測已知+未知檢測已知+未知已知已知ROS1融合檢測已知+未知檢測已知+未知已知難（已知）KRAS突變檢測已知+未知檢測已知+未知已知已知針對非小細胞肺癌的8個基因NGS可以完全覆蓋NGS與ddPC12MET14exonskipping，HER220exoninsertion等情況復雜的突變EGFR等熱點基因的非熱點突變位點ALK等熱點基因的非常見融合方式約3/4ALK融合為經典的EML4-ALK融合，但有1/4為與其他基因的融合，包括：STRN-ALKCATSPERB-ALKACVR1-ALKCLIP1-ALKDPH6-AS1-ALKKIF5B-ALKRP11-320M2.1-ALKUGP2-ALK罕見的EGFR-19Del可能會造成PCR方法假陰性

NGS能夠覆蓋傳統方法和ddPCR無法檢測的突變種類MET14exonskipping，HER220e13NGS能夠發現新的耐藥機制15例患者一代TKI進展，T790M+，應用AZD9291后耐藥，經檢測發現三種類型：6例出現C797S5例仍保持T790M，無C797ST790M消失

ThressKSetal,NatMed.2015Jun;21發現AZD9291獲得性耐藥機制----C797S突變NGS能夠發現新的耐藥機制15例患者一代TKI進展，T79014與EGFR不同ALK-TKI的耐藥機制更加復雜NGS檢測EGFR和ALK的耐藥位點都沒有問題。ddPCR只能做T790M這種比較集中出現的耐藥位點檢測。與EGFR不同ALK-TKI的耐藥機制更加復雜NGS檢測EG15隨著建庫技術和生物信息分析策略的進步NGS液體活檢敏感性已經遠超ddPCR隨著建庫技術和生物信息分析策略的進步NGS液體活檢敏感性已經16在腫瘤克隆進化的過程中，勞拉替尼耐藥相關亞克隆L1198F重拾對克唑替尼的敏感性ShawATetal,NEnglJMed.2016;374(1):54-61.BordiPetal,NEnglJMed.2016;374(18):1790.

評論：相比反復活檢在臨床面臨的巨大挑戰，ctDNA動態隨訪是對腫瘤克隆進化監控的最佳方式NGS檢測能夠幫助分析腫瘤克隆的進化在腫瘤克隆進化的過程中，勞拉替尼耐藥相關亞克隆L1198F重17N.Rizvietal,Science,vol348,2015全外顯子測序結果有助于評估接受免疫治療的患者預后N.Rizvietal,Science,vol318Delpuetal.Int.J.Mol.Sci.

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