新浪微博@analysisDMPK2014-12體內藥物分析

BiopharmaceuticalAnalysis;

BiomedicalAnalysis2023/8/4.1新浪微博@analysisDMPK體內藥物分析

Biopha乳酸左氧氟沙星（0.1g/片）用法用量：口服。成人常用量：支氣管感染、肺部感染：一次2片，一日2次，或一次1片，一日3次，療程7-14日。急性單純性下尿路感染：一次1片，一日2次，療程5～7日；復雜性尿路感染：一次2片，一日2次，或一次1片，一日3次，療程10～14日。細菌性前列腺炎：一次2片，一日2次，療程6周。0.3-0.4g/日0.2g/日0.4g/日2023/8/4.2乳酸左氧氟沙星（0.1g/片）用法用量：0.3-0.4g/日抗菌藥物的抗菌活性藥物抑制或者殺滅病原菌的能力最低抑菌濃度（minimuminhibitoryconcentration）抑制培養基內細菌生長的最低濃度。MIC最低殺菌濃度（minimumbactericidalconcentration）殺滅培養基內99.9%的微生物。MBC喹諾酮類藥物對致病菌的殺菌作用取決于藥物血藥濃度的峰濃度，即藥物濃度越高，殺菌作用越強。——濃度依賴性時間依賴性——殺菌活性與藥物濃度維持在MIC以上時間的長短有關。β-內酰胺類、林可霉素類等抗生素。2023/8/4.3抗菌藥物的抗菌活性藥物抑制或者殺滅病原菌的能力2023/7/乳酸左氧氟沙星（0.1g/片）用法用量：口服。成人常用量：支氣管感染、肺部感染：

藥物隨著血液到各個組織急性單純性下尿路感染：

藥物通過尿液排泄在下尿路發揮治療作用細菌性前列腺炎：

藥物隨著血液到前列腺組織0.3-0.4g/日0.2g/日0.4g/日測定血液、尿液甚至組織中的藥物濃度2023/8/4.4乳酸左氧氟沙星（0.1g/片）用法用量：0.3-0.4g/日1.1體內藥物分析的定義體內樣品（生物體液、器官或組織）中藥物及其代謝產物或內源性生物活性物質的定性、定量分析。體內樣品——確定分析對象藥物、代謝產物、內源性生物活性物質——確定待分析物定性、定量分析——如何選擇分析手段、建立方法并驗證1.概述2023/8/4.51.1體內藥物分析的定義體內樣品（生物體液、器官或組織）中藥體內·藥物·分析原料藥純度高

干擾少容量分析為主制劑主藥一或多

輔料干擾多儀器分析為主體內藥物成分復雜

干擾眾多

濃度很低高靈敏度

高選擇性的方法2023/8/4.6體內·藥物·分析原料藥制劑體內藥物成分復雜

干擾眾多

濃度很1.2體內藥物分析對象和待測物特點★成分復雜、干擾眾多生物基質的干擾——蛋白質、糖、脂肪、離子……其他藥物的干擾——卡馬西平治療癲癇的有效血藥濃度為3~8μg/ml，潛在中毒濃度為12μg/ml。病人可能之前用過其他抗癲癇藥物如丙戊酸鈉、乙琥胺等。代謝產物與原型藥物互相干擾——抗抑郁藥米氮平DMR8-OHMN-O-MRT方法選擇性要高2023/8/4.71.2體內藥物分析對象和待測物特點★成分復雜、干擾眾多DMR體內藥物分析對象和待測物特點★采樣量小，濃度很低常見的生物樣品采樣量少，特定條件采集，不易重新獲得

血漿：人1~3ml；犬1~5ml；大鼠0.3~0.5ml濃度為ng/ml~μg/ml數量級血液（血漿、血清、全血）、尿液、唾液、膽汁、乳汁、腦脊液等均勻生物樣品心、肝、脾、肺、腎、腦等非均勻生物樣品方法靈敏度要高2023/8/4.8體內藥物分析對象和待測物特點★采樣量小，濃度很低血液（血漿、1.3體內藥物分析方法的特點★對分析方法的要求高：滿足靈敏度及專屬性的要求樣品需要經過前處理，才能分析分析工作量大，方法驗證要求嚴格，測試數據處理和結果闡明較為復雜1.概述2023/8/4.91.3體內藥物分析方法的特點★對分析方法的要求高：滿足靈敏1.4體內藥物分析的任務定性分析——藥物代謝產物、內源性物質是什么定量分析——血漿、組織、尿液藥物及代謝物濃度藥物代謝與動力學（drugmetabolismandpharmacokinetics，DMPK）研究——新藥研發治療藥物監測（TherapeuticDrugMonitoring，TDM）——臨床應用內源性物質檢測——疾病標志物社會事件中的分析——食品安全、法醫毒物分析等1.概述2023/8/4.101.4體內藥物分析的任務定性分析——藥物代謝產物、內源性物質體內藥物分析的任務：DMPK藥代動力學研究涉及藥物在體內的吸收、分布、代謝與排泄等動態過程，需要研究血藥/組織濃度－時間曲線的變化，探討藥物分布與藥理作用的關系。1,2–Stability+Solubility3–Passive+ActiveTrans.4–Pgpefflux+CYP3A45-Hepaticfirstpasseffect2023/8/4.11體內藥物分析的任務：DMPK藥代動力學研究涉及藥物在體內的吸藥物代謝與動力學血藥濃度-時間曲線尿藥累積排泄曲線生物等效性評價絕對生物利用度相對生物利用度代謝途徑代謝酶……2023/8/4.12藥物代謝與動力學血藥濃度-時間曲線2023/7/25.12體內藥物分析的任務：TDMTDM即測定血液中或其它體液中藥物濃度，觀察臨床藥物反應，考察藥物治療效果，必要時根據藥動學原理調整給藥方案。方向是實現個體化給藥，目的為臨床合理用藥服務，達到最佳的藥物治療效果。治療范圍中毒范圍無效范圍C最大耐受濃度最小有效濃度2023/8/4.13體內藥物分析的任務：TDMTDM即測定血液中或其它體液中藥物治療藥物監測血藥濃度μg/ml10~2020~3030~40>40藥理及

毒性反應有效血藥濃度眼球震顫運動失調精神異常抗癲癇藥苯妥英鈉血藥濃度與藥理作用及毒性反應患者女性，25歲，因癲癇強直陣攣性發作入院，遂靜脈注射負荷劑量苯妥英鈉800mg并開始口服維持劑量250mg/d。測得苯妥英鈉的濃度為3.6μg/ml，醫生考慮到尚未達到治療濃度范圍，故增加劑量到400mg/d。患者出現痙攣等類似癲癇發作癥狀。測得血藥濃度為10.9μg/ml，醫生擬打算再次增加劑量。患者白蛋白為20g/L(正常范圍是34~48g/L)，于是建議檢查患者游離苯妥英鈉濃度。結果顯示游離苯妥英鈉濃度為4.9μg/ml（游離藥物治療濃度范圍1~2μg/ml），判定患者苯妥英鈉中毒，建議降低劑量為250mg/d。2023/8/4.14治療藥物監測血藥濃度μg/ml10~2020~3030~40體內藥物分析的任務：內源性物質檢測體內內源性物質如氨基酸、激素、兒茶酚胺、肌酐、草酸、尿酸等。機體正常生理條件或機體發生病變：測定體內內源性物質或疾病標志物的含量，疾病的輔助診斷或及早預防。藥物（中藥）代謝組學研究2023/8/4.15體內藥物分析的任務：內源性物質檢測體內內源性物質如氨基酸、激體內藥物分析的中心任務體內藥物分析方法學研究生物樣品預處理方法分離分析實驗條件的優化選擇考察體內分析方法的靈敏度、專屬性、準確度、線性范圍等為臨床藥理學、臨床藥學等相關學科提供專一、靈敏、準確、快速、簡便的體內藥物分析方法。2023/8/4.16體內藥物分析的中心任務體內藥物分析方法學研究2023/7/22.1體內樣品的種類與采集血液（血漿、血清、全血）、尿液、唾液、膽汁、乳汁、腦脊液等均勻生物樣品心、肝、脾、肺、腎、腦等非均勻生物樣品樣品選取原則（1）必須是能夠反映出濃度與藥物效應之間關系；（2）易于獲得；（3）便于處理，適合于分析；（4）根據不同目的與要求進行選取。2.體內樣品的種類、采集與貯存2023/8/4.172.1體內樣品的種類與采集血液（血漿、血清、全血）、尿液、唾體內樣品種類與采集血液自然凝結加抗凝劑離心離心全血上層：血清serum（比血漿少纖維蛋白原）（40%）下層：血細胞（凝塊）上層：血漿plasma（50%）下層：血細胞血樣Blood一般在給藥后的不同時間點采集血樣2023/8/4.18體內樣品種類與采集血液自然凝結加抗凝劑離心離心全血上層：血清體內樣品種類與采集尿樣Urine特點：尿藥濃度通常變化較大；尿藥大多呈結合狀態。優點：易得，且樣品量多；正常尿液僅含微量蛋白。缺點：尿液是一種良好的細菌培養基；尿液中多具有紫外吸收的化合物。一般在給藥后的不同時間段收集尿樣2023/8/4.19體內樣品種類與采集尿樣Urine一般在給藥后的不同時間段收集體內樣品種類與采集唾液Saliva優點：非傷害性采樣，且不受時間地點限制。缺點1：唾液藥濃一般低于血漿藥濃；

某些藥物的唾液藥濃（S）與血漿游離藥濃（UP）十分接近，但兩者相關系數不明確；

pH改變會影響弱酸性和弱堿性藥物在唾液中的藥物濃度。一般自然采集或刺激采集，量少2023/8/4.20體內樣品種類與采集唾液Saliva一般自然采集或刺激采集，量體內樣品的種類與采集組織tissue指各種體內臟器，需要對其進行均勻化制備，使之成勻漿溶液反應藥物在臟器的分布與蓄積情況頭發hair取樣方便，可以獲得長期的用藥史信息前處理復雜，需要排除頭發表面的各種干擾2023/8/4.21體內樣品的種類與采集組織tissue2023/7/25.212.2體內樣品貯存與處理室溫放置時間短期保存溫度與時間長期保存溫度與時間-20、-40、-80℃分裝保存——便于測定去活性保存——防止酶降解保存溫度與時間由

什么決定？2.體內樣品的種類、采集與貯存2023/8/4.222.2體內樣品貯存與處理室溫放置時間保存溫度與時間由

什么研究維生素C泡騰片進入人體后血藥濃度-時間曲線變化，通過測定給藥后人血漿中維生素C實現。問：采集血樣之后如何保存？維生素C的性質？維生素C容易氧化，因此采集血樣后加入抗氧劑保存。2023/8/4.23研究維生素C泡騰片進入人體后血藥濃度-時間曲線變化，通過測定3.1體內藥物分析的一般流程

血樣尿液唾液膽汁組織器官前處理方法

分離純化濃集樣品測定方法建立方法優化方法學研究靈敏度準確度精密度線性和范圍耐用性……靈敏、準確、快速、簡便3.體內藥物分析方法的建立與評價2023/8/4.243.1體內藥物分析的一般流程前處理方法樣品測定方法學研究新藥臨床藥物代謝動力學評價新藥I期臨床試驗階段中進行藥物在健康志愿者體內藥物代謝動力學，探討藥物在體內吸收、分布和消除的特點，為II期臨床實驗的給藥方案制定提供倫理依據。研究內容包括健康受試者單次與多次給藥的藥物代謝動力學研究、飲食的影響、代謝產物的代謝動力學研究、藥物-藥物的代謝動力學相互作用研究等。體內藥物分析方法是關鍵2023/8/4.25新藥臨床藥物代謝動力學評價新藥I期臨床試驗階段中進行藥物在健人血漿中普盧利沙星活性代謝產物NM394的檢測羧基：酸性基團哌嗪環：堿性、水溶性增加共軛結構2023/8/4.26人血漿中普盧利沙星活性代謝產物NM394的檢測羧基：酸性基團分析方法建立分析待測物——NM394分析目標——建立分析方法可以專屬、靈敏、準確的檢測出血漿中NM394HPLC法——分離分析選擇內標化合物——準確定量選擇前處理方法——消除干擾、提高檢測濃度2023/8/4.27分析方法建立分析待測物——NM3942023/7/25.27分析方法的建立—色譜條件及優化體外方法的建立色譜柱：DiamonsilC18柱(5μm,200mm×4.6mmi.d.)保護柱：DiamonsilTMODS流動相：乙腈-0.5%三乙胺（磷酸調pH3.0）為21:79流速：1ml/min熒光檢測：λex-280nm,λem-425nm柱溫：30℃內標化合物為洛美沙星（結構類似、性質相近）2023/8/4.28分析方法的建立—色譜條件及優化體外方法的建立2023/7/2分析方法的建立—樣品前處理分析方法的優化必須考慮

生物樣品的前處理的影響？2023/8/4.29分析方法的建立—樣品前處理分析方法的優化必須考慮

生物樣品的3.2體內分析樣品前處理3.2.1生物樣品前處理的目的純化藥物，消除干擾凈化滿足檢測靈敏度的要求富集減少對分析儀器的污染改善分析環境除非生物樣品基質不會干擾檢測，也不會污染儀器，同時還有較好的靈敏度3.體內藥物分析方法的建立與評價2023/8/4.303.2體內分析樣品前處理3.2.1生物樣品前處理的目的3.示例：血液中酒精的檢測（直接測定）頂空氣相色譜火焰離子化檢測器進行檢測0.2ml全血和0.5ml內標放到小瓶后迅速封口小瓶被放到頂空進樣器上自動加熱獲得氣液兩相平衡將液上氣體注入GC分析2023/8/4.31示例：血液中酒精的檢測（直接測定）頂空氣相色譜火焰離子化檢測3.2.2蛋白沉淀proteinprecipitationPPT★測定血樣時用，去除蛋白質，使結合的藥物釋放出來有機溶劑沉淀法（甲醇、乙腈）中性鹽析法（飽和硫酸銨）強酸沉淀法（高氯酸）使蛋白變性后除去2023/8/4.323.2.2蛋白沉淀proteinprecipitatio蛋白沉淀過程示意圖A B C DA血漿樣品200μlB加入甲醇600μlC渦旋混合3min后D10000rpm離心10min后2023/8/4.33蛋白沉淀過程示意圖A B C DA血漿樣品200μl2034沉淀劑每1容積血漿加入沉淀劑容積0.21.02.03.04.0甲醇17.673.498.798.999.2乙腈13.497.299.799.899.810%三氯醋酸99.799.599.899.899.8鎢酸鹽-硫酸3.399.799.899.9100.0(飽和)硫酸銨21.353.498.3**CuSO4-Na2WO436.597.599.9100.0100.0ZnSO4-NaOH41.194.299.398.899.6常用蛋白沉淀劑的用量及沉淀蛋白的百分率*：樣品渾濁，妨礙準確測定2023/8/4.3434沉淀劑每1容積血漿加入沉淀劑容積0.21.02.03.0蛋白沉淀應用特點確定沉淀劑與血漿的最佳比例稀釋倍數滿足檢測靈敏度的要求盡可能多沉淀蛋白，減少對儀器的污染適合濃度較高的血樣處理過程快速，適合不穩定的藥物測定2023/8/4.35蛋白沉淀應用特點確定沉淀劑與血漿的最佳比例2023/7/253.2.3液液萃取liquid-liquidextractionLLE★常選擇與水不混溶的有機溶劑，根據藥物在水中與有機溶劑中的溶解度不同而將目標藥物和干擾物質分開，隨后濃縮含有目標藥物的有機層體液中內源性物質多為極性成分藥物多為親脂性弱酸或弱堿2023/8/4.363.2.3液液萃取liquid-liquidextrac液液萃取示意圖取1ml血漿

置具塞玻璃離心管中精密加入5ml

乙酸乙酯

提取溶劑充分渦旋混合3min2023/8/4.37液液萃取示意圖取1ml血漿

置具塞玻璃離心管中精密加入5ml液液萃取示意圖4000rpm

離心10min后準確取出上層有機溶劑置另一干凈具塞玻璃離心管置N2下水浴揮干溶劑殘留物用流動相溶解離心后進樣HPLC分析便于純化與富集2023/8/4.38液液萃取示意圖4000rpm

離心10min后準確取出上層液液萃取應用特點確定合適的萃取溶劑依據相似相溶原則正己烷→乙醚→乙酸乙酯→正丁醇

極性增大有機相:水相=1:1~5:12023/8/4.39液液萃取應用特點確定合適的萃取溶劑2023/7/25.39示例：尿液中甲基苯丙胺與苯丙胺的檢測（液液萃取）取尿液2ml，置于5ml離心管中，加入5ml乙醚，渦旋，離心，取乙醚層置另一5ml離心管中，60度水浴氮氣流下揮干取尿液2ml，置于5ml離心管中，加入100μl0.1mol/lNaOH，混勻后加入5ml乙醚，渦旋，離心，取乙醚層置另一5ml離心管中，60度水浴氮氣流下揮干甲基苯丙胺（冰毒）苯丙胺2023/8/4.40示例：尿液中甲基苯丙胺與苯丙胺的檢測（液液萃取）甲基苯丙胺（液液萃取應用特點調節水相pH值水相pH值主要由藥物的pKa確定堿性藥物最佳pH值要高于pKa值1-2個pH單位酸性藥物則要低1-2個pH單位pKa9.9pKa10.1酸化：0.1mol/lHCl

堿化：0.1mol/lNaOH2023/8/4.41液液萃取應用特點調節水相pH值pKa9.9pKa10.13.2.4.固相萃取solid-phaseextractionSPE

★根據色譜理論發展的一種前處理方式將具有吸附、分配或離子交換性質的擔體作為萃取劑填入小柱，溶劑淋洗活化后，將生物樣品通過小柱，使其藥物或雜質保留在擔體上，選擇一種溶劑洗去雜質，再用適當溶劑將藥物洗脫下來。常用擔體：疏水性的C18化學鍵合硅膠等2023/8/4.423.2.4.固相萃取solid-phaseextrac固相萃取基本操作固定相C18先甲醇潤濕小柱

再用水除去多余甲醇1)活化2023/8/4.43固相萃取基本操作固定相C18先甲醇潤濕小柱

再用水除去多余固相萃取基本操作1)活化2)上樣液體樣品內源性物質其他外源性物質待測藥物2023/8/4.44固相萃取基本操作1)活化液體樣品內源性物質其他外源性物質待測固相萃取基本操作1)活化2)上樣3)淋洗選擇不同極性溶劑

依次為：水，由低到高比例的甲醇內源性物質其他外源性物質待測藥物淋洗溶劑2023/8/4.45固相萃取基本操作1)活化3)淋洗選擇不同極性溶劑

依次為：固相萃取基本操作1)活化2)上樣3)淋洗淋洗的目的：除去生物樣品的干擾，待測藥物仍然保留在SPE柱上內源性物質其他外源性物質待測藥物淋洗溶劑2023/8/4.46固相萃取基本操作1)活化3)淋洗淋洗的目的：除去生物樣品的固相萃取基本操作1)活化2)上樣3)淋洗4)洗脫100%甲醇為洗脫劑內源性物質其他外源性物質待測藥物淋洗溶劑洗脫溶劑2023/8/4.47固相萃取基本操作1)活化3)淋洗4)洗脫100%甲醇為洗固相萃取基本操作收集洗脫液，其中含有待測藥物直接進樣分析

濃縮后進樣分析待測藥物洗脫溶劑1)活化2)上樣3)淋洗4)洗脫2023/8/4.48固相萃取基本操作收集洗脫液，其中含有待測藥物直接進樣分析

濃固相萃取基本操作內源性物質其他外源性物質待測藥物淋洗溶劑洗脫溶劑活化上樣淋洗洗脫2023/8/4.49固相萃取基本操作內源性物質其他外源性物質待測藥物淋洗溶劑洗脫固相萃取應用特點根據藥物性質選擇適合的柱填料，以提高提取回收率處理速度快，具有一定通量，較容易自動化或聯用2023/8/4.50固相萃取應用特點根據藥物性質選擇適合的柱填料，以提高提取回收3.2.5其他處理方式固體樣品均勻化處理組織樣品——按照1:4(w/v)用生理鹽水或緩沖液進行勻漿，勻漿前剪碎組織糞便樣品——低溫烘干后，取樣品研碎，用適當溶劑萃取（超聲）注意保證取樣均一2023/8/4.513.2.5其他處理方式固體樣品均勻化處理2023/7/25523.2.5其他處理方式綴合物的水解藥物或者其代謝產物與體內內源性物質結合生成的產物稱為綴合物。常見葡萄糖醛酸苷綴合物和硫酸酯綴合物綴合物較原型藥物具有較大的極性，有機溶劑不易提取。常用酸水解、酶水解的方法使藥物釋放出2023/8/4.52523.2.5其他處理方式綴合物的水解2023/7/25.血漿中NM394的樣品前處理液液萃取：有一定水溶性，提取溶劑中需要加入一些極性溶劑蛋白沉淀：完全可以固相萃取：完全可以本實驗研究選擇蛋白沉淀為前處理方法：200μl血漿+50μl內標溶液+100μl

10%高氯酸溶液→渦旋混勻3min

→10000rpm離心10min

→上清液取出二次離心10000rpm10min

→上清液20μl進樣HPLC分析考察不同蛋白沉淀劑對方法專屬性的影響，和對絕對回收率的影響——決定的檢測靈敏度2023/8/4.53血漿中NM394的樣品前處理液液萃取：有一定水溶性，提取溶劑3.3體內樣品分析方法學驗證特異性標準曲線與定量范圍定量下限精密度與準確度穩定性提取回收率分析過程質量控制超限樣品處理3.體內藥物分析方法的建立與評價專屬性標準曲線與定量范圍定量限/檢測限精密度與準確度耐用性質量標準分析方法驗證內容體內樣品分析方法學驗證內容概念相似方法不同2023/8/4.543.3體內樣品分析方法學驗證特異性3.體內藥物分析方法的建立血漿中NM394檢測的特異性內標NM394內源性物質是否有干擾未知代謝物是否有干擾與色譜分析方法有關與前處理方法有關2023/8/4.55血漿中NM394檢測的特異性內標NM394內源性物質是否有干血漿中NM394檢測的提取回收率提取回收率又叫絕對回收率，指從生物樣品中回收得到待測物的響應值與標準物質產生的響應值的比值。

180μl血漿+20μl1

μg/ml對照品溶液=200μl標準添加血漿0.1μg/ml前處理：+50

μl內標溶液+100μl

10%高氯酸溶液沉淀濃度0.1*0.2/0.35→分子上的響應值流動相配制濃度為0.1*0.2/0.35的對照品溶液→分母上的響應值2023/8/4.56血漿中NM394檢測的提取回收率提取回收率又叫絕對回收率，指血漿中NM394檢測的提取回收率評價分析方法將體內樣品中的待測物從生物基質中提取出來的能力★提取回收率高，檢測靈敏度就高要求在不同濃度上，具有較為接近的提取回收率即可測定濃度μg/ml提取回收率0.0278.30.1081.50.8084.32023/8/4.57血漿中NM394檢測的提取回收率評價分析方法將體內樣品中的待血漿中NM394的線性范圍、定量下限采用內標工作曲線法定量配制血漿標準曲線系列濃度樣品（標準曲線樣品也是經過前處理之后才能進樣分析的，這與體外質量標準完全不同）0.01,0.02,0.05,0.10,0.20,0.50,1.00μg/ml范圍由預實驗確定，定量下限需要滿足準確測定出藥物經過3~5個半衰期后體內濃度；或者藥物達峰濃度的1/10~1/20。定量上限應高于達峰濃度。較寬的工作曲線范圍。2023/8/4.58血漿中NM394的線性范圍、定量下限采用內標工作曲線法定量2血漿中NM394的線性范圍、定量下限定量下限濃度μg/ml內標NM394比值0.01234882.65801.60.02470.012334505532.10.0236970.01246342.85205.90.0211330.01235620.25320.10.0225790.0122145051220.023129y=2.3051x-0.0062定量下限濃度一般較低，因此該濃度點的準確度、精密度也是需要考察的內容2023/8/4.59血漿中NM394的線性范圍、定量