生物學信息分析第1頁，課件共81頁，創作于2023年2月實驗目的了解相關的生物信息學數據庫（NCBI數據庫等）和掌握數據庫檢索方法，學會相關軟件的使用，并利用生物信息學軟件根據研究目的和對象設計引物。第2頁，課件共81頁，創作于2023年2月方法根據酶或基因的名稱（GenBank登錄號）找到需要的基因的核苷酸序列，根據序列和PCR的目的設計獲得該基因的CDS的引物(注意引物設計時引物酶切位點)。

第3頁，課件共81頁，創作于2023年2月目的基因序列的檢索第4頁，課件共81頁，創作于2023年2月主要數據庫介紹GenebankEMBLDDBJ

第5頁，課件共81頁，創作于2023年2月Genebank

Genebank庫包含了所有已知的核酸序列和蛋白質序列，以及與它們相關的文獻著作和生物學注釋。它是由美國國立生物技術信息中心(NCBI)建立和維護的。NCBI的網址是：第6頁，課件共81頁，創作于2023年2月EMBL核酸序列數據庫

由歐洲生物信息學研究所(EBI)維護的核酸序列數據構成，查詢檢索可以通過通過因特網上的序列提取系統(SRS)服務完成。數據庫網址是：http://www.ebi.ac.uk/embl/

第7頁，課件共81頁，創作于2023年2月DDBJ數據庫

日本DNA數據倉庫(DDBJ)也是一個全面的核酸序列數據庫，與Genbank和EMBL核酸庫合作交換數據。使用其主頁上提供的SRS工具進行數據檢索和序列分析。DDBJ的網址是：http://www.ddbj.nig.ac.jp/第8頁，課件共81頁，創作于2023年2月NCBI介紹：NCBI建立在1988年,作為一種公共分子生物學信息資源,而創建的公開數據庫。NCBI的計劃：1.基本研究；2.數據庫；3.軟件的開發；4.教育和訓練第9頁，課件共81頁，創作于2023年2月現在我們以查找甘薯異戊烯氯喹異構酶（Ipomoeabatatasisopentenyldiphosphateisomerase，ipi）的編碼序列為例，介紹如何從ＮＣＢＩ中在線獲取所需要的核酸序列．應用舉例第10頁，課件共81頁，創作于2023年2月1.進入第11頁，課件共81頁，創作于2023年2月2.選擇數據庫3.查詢關鍵詞4.開始查詢第12頁，課件共81頁，創作于2023年2月顯示格式符合條件的記錄數每頁顯示數目第13頁，課件共81頁，創作于2023年2月相關記錄點擊進入第14頁，課件共81頁，創作于2023年2月Genbank格式的序列記錄第15頁，課件共81頁，創作于2023年2月第16頁，課件共81頁，創作于2023年2月FASTA格式的序列記錄第17頁，課件共81頁，創作于2023年2月基因表達的

ORF分析第18頁，課件共81頁，創作于2023年2月

aagcaagacgccaagggccaaggctggctgcaagaagcaaagaggaacgaacactgtgaa61tatcccaatgtcgatgatggcttctgttcaaatctgtcggagattctctcccctagtcgc121ccggccggcgatttactctgccaattcttcattcctctcaccagtctctttcgcctcttc181ttctctttcaattatgccgatccgcctccgctgcagagcttcagtacactctgtccgcgc241cgcctccaccatgggggacaccatcactgatgccaacatggatgctgtccagcgccgcct301catgtttgacgacgagtgtattttggtggatgagaatgaccgtgttgttggtcatgatac361caagtataattgtcatcttatggagaagattgaatctgagaatctgcttcacagagcttt421cagtgttttcttatttaattcaaactatgagttgcttcttcagcaacgatctgcgacaaa481ggtcaccttccctttggtgtggactaacacctgctgcagccatcctctgtaccgggagtc541tgagttgattgaagagaatgctcttggtgtgaggaatgctgcacaaagaaagcttcttga601tgaactggggattcctgcagaggatgtcccagttgatgaattcacaacattgggccgtat661cctgtataaagcaccttctgatgggagatggggagagcatgaacttgattatcttctctt721cattgtgagggatgttggcatgcacccaaacccggatgaggttgcagatgttaaatatgt781gaatagggaacagctgaaagagatcttgaggaaagcaaatgctggagaggatggtataaa841gctttccccttggttcagattagtcgtcgaaaatttcttgttcaaatggtgggatcatgt901cgagaaaggcaccctaatggaagctgcagatatgaaaaccattcacaagttggcctaaac961agccattggctgagcttttgttaaacccttacatctaccattcacttaactgagcaaaaa1021tatattctatggtcttctgcttagtttcatgcttcatgcttgaactttcaagttttatgt1081tacttttggctgttaggaactagtaatatatgtgaacttgctatcaaaaaaaaaaaaaaa1141aaaaaaaaaaaaaaa//第19頁，課件共81頁，創作于2023年2月基因表達的ORF分析利用計算機和互聯網，對核酸序列的所有相位進行搜索可以很快地獲得ＯＲＦ結果。國際互聯網上的ＯＲＦ分析資源有：/gorf/查找);http://expasy.hcuge.ch/www/dna.html(將ＤＮＡ翻譯為蛋白質)。第20頁，課件共81頁，創作于2023年2月第21頁，課件共81頁，創作于2023年2月第22頁，課件共81頁，創作于2023年2月第23頁，課件共81頁，創作于2023年2月第24頁，課件共81頁，創作于2023年2月核酸序列的

比對分析第25頁，課件共81頁，創作于2023年2月對核酸序列的首要分析是聯網進行序列的同源性分析，以便能夠利用最新的數據庫反映該序列是否是已知序列以及與已知序列同源性的高低。典型的分析是采用NCBI的BLAST軟件對GENBANK中的非冗余數據庫（non-redundantdatabase,nr）進行查詢。該數據庫是對GENBANK、EMBL和DDBJ中去除所有相同核酸序列進行整合后所得到的最為全面的已知基因數據庫，其中還包括了部分基因組的序列。第26頁，課件共81頁，創作于2023年2月運行時聯網至：/BLAST按照提示進行查詢。第27頁，課件共81頁，創作于2023年2月ggggtcgagtccgcgtccacccgcgagtacaaccttcttgcagctcctccgtcgccggtc61cacacccgccaccagttcgccatggatgacgatatcgctgcgctcgtcgtcgacaacggc121tccggcatgtgcaaggccggcttcgcgggcgacgatgctccccgggccgtcttcccctcc181atcgtgggccgccctaggcaccagggtgtgatggtgggtatgggtcagaaggactcctac241gtgggcgacgaggcccagagcaagagaggcatcctgaccctgaagtaccccattgaacac301ggcattgtcaccaactgggacgatatggagaagatttggcaccacactttctacaatgag361ctgcgtgtggcccctgaggagcaccctgtgctgctcaccgaggcccctctgaaccctaag421gccaaccgtgaaaagatgacccagatcatgtttgagaccttcaacaccccagccatgtac481gtagccatccaggctgtgttgtccctgtatgcctctggtcgtaccactggcattgtgatg541gactccggagacggggtcacccacactgtgcccatctatgagggttacgcgctccctcat601gccatcctgcgtctggacctggctggccgggacctgacagactacctcatgaagatcctg661accgagcgtggctacagcttcaccaccacagctgagagggaaatcgtgcgtgacattaaa721gagaagctgtgctatgttgccctagacttcgagcaagagatggccactgccgcatcctct781tcctccctggagaagagctatgagctgcctgacggtcaggtcatcactatcggcaatgag841cggttccgatgccccgaggctctcttccagccttccttcctgggtatggaatcctgtggc901atccatgaaactacattcaattccatcatgaagtgtgacgttgacatccgtaaagacctc961tatgccaacacagtgctgtctggtggcaccaccatgtacccaggcattgctgacaggatg1021cagaaggagattactgccctggctcctagcaccatgaagatcaagatcattgctcctcct1081gagcgcaagtactctgtgtggattggtggctctatcctggcctcactgtccaccttccag1141cagatgtggatcagcaagcaggagtacgatgagtccggcccctccatcgtgcaccgcaaa1201tgcttctaggcggactgttactgagctgcgttttacaccctttctttgacaaaacctaac1261ttgcgcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa//第28頁，課件共81頁，創作于2023年2月點擊第29頁，課件共81頁，創作于2023年2月第30頁，課件共81頁，創作于2023年2月第31頁，課件共81頁，創作于2023年2月第32頁，課件共81頁，創作于2023年2月第33頁，課件共81頁，創作于2023年2月第34頁，課件共81頁，創作于2023年2月第35頁，課件共81頁，創作于2023年2月第36頁，課件共81頁，創作于2023年2月點擊第37頁，課件共81頁，創作于2023年2月第38頁，課件共81頁，創作于2023年2月PCR引物設計第39頁，課件共81頁，創作于2023年2月PCR基本原理Mg2+AGGCTTAAGGGCATAGTAGGC-5’3’-TAATCCCGATTATCCCGT-3’AGGCCCCGTTTAACCCGTTTAATA5’--3’3’--5’AGGCTTAAGGGCATAGTAGGC5’-3’--5’CCCGTTTAACCCGTTTAACCGTA-3’TAATTA-3’5’-3’-TTAAGGGCATTAAGGGCATAGGC-5’80℃60℃40℃30℃50℃72℃90℃94℃TTAAGGGCATAGTACCCGATTATCCCGT5’-第40頁，課件共81頁，創作于2023年2月因此，引物設計是整個工作的基礎和關鍵。第41頁，課件共81頁，創作于2023年2月引物設計的原則1.引物的長度一般為15-30bp，常用的是18-27bp，但不應大于38bp2.引物3’端出現3個以上的連續堿基，特別是GGG

或CCC第42頁，課件共81頁，創作于2023年2月引物設計的原則3.引物3’端的末位堿基對Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯配位置導致不同的擴增效率，末位堿基為A的錯配效率明顯高于其他3個堿基。

4.5’端序列對PCR影響不太大，因此常用來引進修飾位點或標記物。

5.引物二聚體或發夾結構也可能導致PCR反應失敗。第43頁，課件共81頁，創作于2023年2月引物二聚體Mg2+CGTATTAAGGGCATTAAGGGCATAGGCGAATMg2+-3’-3’3’-5’--5’TAATDNA聚合酶TAATCATT80℃60℃40℃30℃50℃72℃90℃94℃CATT第44頁，課件共81頁，創作于2023年2月引物二聚體Mg2+CGTATTAAGGGCATTAAGGGCATAGGCGAATMg2+-3’-3’3’-5’--5’TAATDNA聚合酶TAATCATT80℃60℃40℃30℃50℃72℃90℃94℃CATT第45頁，課件共81頁，創作于2023年2月引物二聚體Mg2+CGTATTAAGGGCATTAAGGGCATAGGCGAATMg2+-3’-3’3’-5’--5’TAATDNA聚合酶TAATCATT80℃60℃40℃30℃50℃72℃90℃94℃CATT第46頁，課件共81頁，創作于2023年2月發夾結構5’３’５’３’第47頁，課件共81頁，創作于2023年2月引物設計的原則

引物二聚體及發夾結構的能值過高:?G≧4.5kcal/mol產生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應效率降低。

第48頁，課件共81頁，創作于2023年2月引物設計的原則6.引物序列的GC含量一般為40-60%，過高或過低都不利于引發反應。上下游引物的GC含量不能相差太大。第49頁，課件共81頁，創作于2023年2月7.引物所對應模板位置序列的Tm值在72℃左右可使復性條件最佳。

Tm值的計算公式:

Tm＝4(G+C)＋2(A+T)引物設計的原則第50頁，課件共81頁，創作于2023年2月引物設計的原則8.?G值是指DNA雙鏈形成（或者打開）所需的自由能，該值反映雙鏈結構內部堿基對的相對穩定性。應當選用3’端?G值較低（絕對值不超過9），而5’端和中間?G值相對較高的引物。引物的3’端的?G值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結構并引發DNA聚合反應。第51頁，課件共81頁，創作于2023年2月這么多要求煩死人了，我抗議！除非……第52頁，課件共81頁，創作于2023年2月常用的引物設計軟件Oligo6（引物評價）*PremierPrimer（自動搜索）*VectorNTISuitDnasisOmigaDnastarPrimer3（在線服務）*第53頁，課件共81頁，創作于2023年2月常用的引物設計軟件PrimerPrimer5.0

的使用技巧簡介1、軟件安裝與主要功能介紹2、引物設計應用舉例第54頁，課件共81頁，創作于2023年2月常用的引物設計軟件我們可以通過網上下載或其它方式獲得安裝軟件1、軟件安裝與主要功能介紹第55頁，課件共81頁，創作于2023年2月2、引物設計應用舉例引物分類：按PCR目的不同可分為檢測引物和克隆引物兩大類.常用的引物設計軟件檢測性引物特點:反應靈敏性、擴增特異性克隆性引物特點:產物完整性和保真性第56頁，課件共81頁，創作于2023年2月PCR引物設計應用舉例

1ctgcaggccactggttaccgggaattgttccggtcaacgcggtattaggtggcgcgctga61gctatctgatccttaacccgattttgaatcgtaaaacgacagcagcaatgacgcatgtgg121aggctaacag

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