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文檔簡介
生物學(xué)信息分析第1頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私庀嚓P(guān)的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(NCBI數(shù)據(jù)庫等)和掌握數(shù)據(jù)庫檢索方法,學(xué)會(huì)相關(guān)軟件的使用,并利用生物信息學(xué)軟件根據(jù)研究目的和對(duì)象設(shè)計(jì)引物。第2頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月方法根據(jù)酶或基因的名稱(GenBank登錄號(hào))找到需要的基因的核苷酸序列,根據(jù)序列和PCR的目的設(shè)計(jì)獲得該基因的CDS的引物(注意引物設(shè)計(jì)時(shí)引物酶切位點(diǎn))。
第3頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月目的基因序列的檢索第4頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月主要數(shù)據(jù)庫介紹GenebankEMBLDDBJ
第5頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月Genebank
Genebank庫包含了所有已知的核酸序列和蛋白質(zhì)序列,以及與它們相關(guān)的文獻(xiàn)著作和生物學(xué)注釋。它是由美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)建立和維護(hù)的。NCBI的網(wǎng)址是:第6頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月EMBL核酸序列數(shù)據(jù)庫
由歐洲生物信息學(xué)研究所(EBI)維護(hù)的核酸序列數(shù)據(jù)構(gòu)成,查詢檢索可以通過通過因特網(wǎng)上的序列提取系統(tǒng)(SRS)服務(wù)完成。數(shù)據(jù)庫網(wǎng)址是:http://www.ebi.ac.uk/embl/
第7頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月DDBJ數(shù)據(jù)庫
日本DNA數(shù)據(jù)倉庫(DDBJ)也是一個(gè)全面的核酸序列數(shù)據(jù)庫,與Genbank和EMBL核酸庫合作交換數(shù)據(jù)。使用其主頁上提供的SRS工具進(jìn)行數(shù)據(jù)檢索和序列分析。DDBJ的網(wǎng)址是:http://www.ddbj.nig.ac.jp/第8頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月NCBI介紹:NCBI建立在1988年,作為一種公共分子生物學(xué)信息資源,而創(chuàng)建的公開數(shù)據(jù)庫。NCBI的計(jì)劃:1.基本研究;2.數(shù)據(jù)庫;3.軟件的開發(fā);4.教育和訓(xùn)練第9頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月現(xiàn)在我們以查找甘薯異戊烯氯喹異構(gòu)酶(Ipomoeabatatasisopentenyldiphosphateisomerase,ipi)的編碼序列為例,介紹如何從NCBI中在線獲取所需要的核酸序列.應(yīng)用舉例第10頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月1.進(jìn)入第11頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月2.選擇數(shù)據(jù)庫3.查詢關(guān)鍵詞4.開始查詢第12頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月顯示格式符合條件的記錄數(shù)每頁顯示數(shù)目第13頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月相關(guān)記錄點(diǎn)擊進(jìn)入第14頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月Genbank格式的序列記錄第15頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月第16頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月FASTA格式的序列記錄第17頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月基因表達(dá)的
ORF分析第18頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月
aagcaagacgccaagggccaaggctggctgcaagaagcaaagaggaacgaacactgtgaa61tatcccaatgtcgatgatggcttctgttcaaatctgtcggagattctctcccctagtcgc121ccggccggcgatttactctgccaattcttcattcctctcaccagtctctttcgcctcttc181ttctctttcaattatgccgatccgcctccgctgcagagcttcagtacactctgtccgcgc241cgcctccaccatgggggacaccatcactgatgccaacatggatgctgtccagcgccgcct301catgtttgacgacgagtgtattttggtggatgagaatgaccgtgttgttggtcatgatac361caagtataattgtcatcttatggagaagattgaatctgagaatctgcttcacagagcttt421cagtgttttcttatttaattcaaactatgagttgcttcttcagcaacgatctgcgacaaa481ggtcaccttccctttggtgtggactaacacctgctgcagccatcctctgtaccgggagtc541tgagttgattgaagagaatgctcttggtgtgaggaatgctgcacaaagaaagcttcttga601tgaactggggattcctgcagaggatgtcccagttgatgaattcacaacattgggccgtat661cctgtataaagcaccttctgatgggagatggggagagcatgaacttgattatcttctctt721cattgtgagggatgttggcatgcacccaaacccggatgaggttgcagatgttaaatatgt781gaatagggaacagctgaaagagatcttgaggaaagcaaatgctggagaggatggtataaa841gctttccccttggttcagattagtcgtcgaaaatttcttgttcaaatggtgggatcatgt901cgagaaaggcaccctaatggaagctgcagatatgaaaaccattcacaagttggcctaaac961agccattggctgagcttttgttaaacccttacatctaccattcacttaactgagcaaaaa1021tatattctatggtcttctgcttagtttcatgcttcatgcttgaactttcaagttttatgt1081tacttttggctgttaggaactagtaatatatgtgaacttgctatcaaaaaaaaaaaaaaa1141aaaaaaaaaaaaaaa//第19頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月基因表達(dá)的ORF分析利用計(jì)算機(jī)和互聯(lián)網(wǎng),對(duì)核酸序列的所有相位進(jìn)行搜索可以很快地獲得ORF結(jié)果。國際互聯(lián)網(wǎng)上的ORF分析資源有:/gorf/查找);http://expasy.hcuge.ch/www/dna.html(將DNA翻譯為蛋白質(zhì))。第20頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月第21頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月第22頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月第23頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月第24頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月核酸序列的
比對(duì)分析第25頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月對(duì)核酸序列的首要分析是聯(lián)網(wǎng)進(jìn)行序列的同源性分析,以便能夠利用最新的數(shù)據(jù)庫反映該序列是否是已知序列以及與已知序列同源性的高低。典型的分析是采用NCBI的BLAST軟件對(duì)GENBANK中的非冗余數(shù)據(jù)庫(non-redundantdatabase,nr)進(jìn)行查詢。該數(shù)據(jù)庫是對(duì)GENBANK、EMBL和DDBJ中去除所有相同核酸序列進(jìn)行整合后所得到的最為全面的已知基因數(shù)據(jù)庫,其中還包括了部分基因組的序列。第26頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月運(yùn)行時(shí)聯(lián)網(wǎng)至:/BLAST按照提示進(jìn)行查詢。第27頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月ggggtcgagtccgcgtccacccgcgagtacaaccttcttgcagctcctccgtcgccggtc61cacacccgccaccagttcgccatggatgacgatatcgctgcgctcgtcgtcgacaacggc121tccggcatgtgcaaggccggcttcgcgggcgacgatgctccccgggccgtcttcccctcc181atcgtgggccgccctaggcaccagggtgtgatggtgggtatgggtcagaaggactcctac241gtgggcgacgaggcccagagcaagagaggcatcctgaccctgaagtaccccattgaacac301ggcattgtcaccaactgggacgatatggagaagatttggcaccacactttctacaatgag361ctgcgtgtggcccctgaggagcaccctgtgctgctcaccgaggcccctctgaaccctaag421gccaaccgtgaaaagatgacccagatcatgtttgagaccttcaacaccccagccatgtac481gtagccatccaggctgtgttgtccctgtatgcctctggtcgtaccactggcattgtgatg541gactccggagacggggtcacccacactgtgcccatctatgagggttacgcgctccctcat601gccatcctgcgtctggacctggctggccgggacctgacagactacctcatgaagatcctg661accgagcgtggctacagcttcaccaccacagctgagagggaaatcgtgcgtgacattaaa721gagaagctgtgctatgttgccctagacttcgagcaagagatggccactgccgcatcctct781tcctccctggagaagagctatgagctgcctgacggtcaggtcatcactatcggcaatgag841cggttccgatgccccgaggctctcttccagccttccttcctgggtatggaatcctgtggc901atccatgaaactacattcaattccatcatgaagtgtgacgttgacatccgtaaagacctc961tatgccaacacagtgctgtctggtggcaccaccatgtacccaggcattgctgacaggatg1021cagaaggagattactgccctggctcctagcaccatgaagatcaagatcattgctcctcct1081gagcgcaagtactctgtgtggattggtggctctatcctggcctcactgtccaccttccag1141cagatgtggatcagcaagcaggagtacgatgagtccggcccctccatcgtgcaccgcaaa1201tgcttctaggcggactgttactgagctgcgttttacaccctttctttgacaaaacctaac1261ttgcgcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa//第28頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月點(diǎn)擊第29頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月第30頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月第31頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月第32頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月第33頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月第34頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月第35頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月第36頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月點(diǎn)擊第37頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月第38頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月PCR引物設(shè)計(jì)第39頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月PCR基本原理Mg2+AGGCTTAAGGGCATAGTAGGC-5’3’-TAATCCCGATTATCCCGT-3’AGGCCCCGTTTAACCCGTTTAATA5’--3’3’--5’AGGCTTAAGGGCATAGTAGGC5’-3’--5’CCCGTTTAACCCGTTTAACCGTA-3’TAATTA-3’5’-3’-TTAAGGGCATTAAGGGCATAGGC-5’80℃60℃40℃30℃50℃72℃90℃94℃TTAAGGGCATAGTACCCGATTATCCCGT5’-第40頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月因此,引物設(shè)計(jì)是整個(gè)工作的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。第41頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月引物設(shè)計(jì)的原則1.引物的長度一般為15-30bp,常用的是18-27bp,但不應(yīng)大于38bp2.引物3’端出現(xiàn)3個(gè)以上的連續(xù)堿基,特別是GGG
或CCC第42頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月引物設(shè)計(jì)的原則3.引物3’端的末位堿基對(duì)Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯(cuò)配位置導(dǎo)致不同的擴(kuò)增效率,末位堿基為A的錯(cuò)配效率明顯高于其他3個(gè)堿基。
4.5’端序列對(duì)PCR影響不太大,因此常用來引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物。
5.引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗。第43頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月引物二聚體Mg2+CGTATTAAGGGCATTAAGGGCATAGGCGAATMg2+-3’-3’3’-5’--5’TAATDNA聚合酶TAATCATT80℃60℃40℃30℃50℃72℃90℃94℃CATT第44頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月引物二聚體Mg2+CGTATTAAGGGCATTAAGGGCATAGGCGAATMg2+-3’-3’3’-5’--5’TAATDNA聚合酶TAATCATT80℃60℃40℃30℃50℃72℃90℃94℃CATT第45頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月引物二聚體Mg2+CGTATTAAGGGCATTAAGGGCATAGGCGAATMg2+-3’-3’3’-5’--5’TAATDNA聚合酶TAATCATT80℃60℃40℃30℃50℃72℃90℃94℃CATT第46頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月發(fā)夾結(jié)構(gòu)5’3’5’3’第47頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月引物設(shè)計(jì)的原則
引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過高:?G≧4.5kcal/mol產(chǎn)生引物二聚體帶,并且降低引物有效濃度而使PCR反應(yīng)效率降低。
第48頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月引物設(shè)計(jì)的原則6.引物序列的GC含量一般為40-60%,過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。第49頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月7.引物所對(duì)應(yīng)模板位置序列的Tm值在72℃左右可使復(fù)性條件最佳。
Tm值的計(jì)算公式:
Tm=4(G+C)+2(A+T)引物設(shè)計(jì)的原則第50頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月引物設(shè)計(jì)的原則8.?G值是指DNA雙鏈形成(或者打開)所需的自由能,該值反映雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)選用3’端?G值較低(絕對(duì)值不超過9),而5’端和中間?G值相對(duì)較高的引物。引物的3’端的?G值過高,容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)。第51頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月這么多要求煩死人了,我抗議!除非……第52頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月常用的引物設(shè)計(jì)軟件Oligo6(引物評(píng)價(jià))*PremierPrimer(自動(dòng)搜索)*VectorNTISuitDnasisOmigaDnastarPrimer3(在線服務(wù))*第53頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月常用的引物設(shè)計(jì)軟件PrimerPrimer5.0
的使用技巧簡介1、軟件安裝與主要功能介紹2、引物設(shè)計(jì)應(yīng)用舉例第54頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月常用的引物設(shè)計(jì)軟件我們可以通過網(wǎng)上下載或其它方式獲得安裝軟件1、軟件安裝與主要功能介紹第55頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月2、引物設(shè)計(jì)應(yīng)用舉例引物分類:按PCR目的不同可分為檢測引物和克隆引物兩大類.常用的引物設(shè)計(jì)軟件檢測性引物特點(diǎn):反應(yīng)靈敏性、擴(kuò)增特異性克隆性引物特點(diǎn):產(chǎn)物完整性和保真性第56頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月PCR引物設(shè)計(jì)應(yīng)用舉例
1ctgcaggccactggttaccgggaattgttccggtcaacgcggtattaggtggcgcgctga61gctatctgatccttaacccgattttgaatcgtaaaacgacagcagcaatgacgcatgtgg121aggctaacag
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tgaacgactgggttacagcgagcttagttt1441atgccggatgcggcgtgaacgccttatccggcctacgtagagcactgaactcgtaggcct1501gataagcgtagcgcatcaggcaattccagccgctgatctgtgtcagcggctaccgtgatt1561cattcccgccaacaaccgcgcattcctccaacgccatgtgcaaaaatgccttcgcagcgg1621ctgtctgccagctg1634第57頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023年2月檢測引物設(shè)計(jì)操作第58頁,課件共81頁,創(chuàng)作于2023
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