生物學(xué)信息分析第1頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私庀嚓P(guān)的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫（NCBI數(shù)據(jù)庫等）和掌握數(shù)據(jù)庫檢索方法，學(xué)會(huì)相關(guān)軟件的使用，并利用生物信息學(xué)軟件根據(jù)研究目的和對(duì)象設(shè)計(jì)引物。第2頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月方法根據(jù)酶或基因的名稱（GenBank登錄號(hào)）找到需要的基因的核苷酸序列，根據(jù)序列和PCR的目的設(shè)計(jì)獲得該基因的CDS的引物(注意引物設(shè)計(jì)時(shí)引物酶切位點(diǎn))。

第3頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月目的基因序列的檢索第4頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月主要數(shù)據(jù)庫介紹GenebankEMBLDDBJ

第5頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月Genebank

Genebank庫包含了所有已知的核酸序列和蛋白質(zhì)序列，以及與它們相關(guān)的文獻(xiàn)著作和生物學(xué)注釋。它是由美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)建立和維護(hù)的。NCBI的網(wǎng)址是：第6頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月EMBL核酸序列數(shù)據(jù)庫

由歐洲生物信息學(xué)研究所(EBI)維護(hù)的核酸序列數(shù)據(jù)構(gòu)成，查詢檢索可以通過通過因特網(wǎng)上的序列提取系統(tǒng)(SRS)服務(wù)完成。數(shù)據(jù)庫網(wǎng)址是：http://www.ebi.ac.uk/embl/

第7頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月DDBJ數(shù)據(jù)庫

日本DNA數(shù)據(jù)倉庫(DDBJ)也是一個(gè)全面的核酸序列數(shù)據(jù)庫，與Genbank和EMBL核酸庫合作交換數(shù)據(jù)。使用其主頁上提供的SRS工具進(jìn)行數(shù)據(jù)檢索和序列分析。DDBJ的網(wǎng)址是：http://www.ddbj.nig.ac.jp/第8頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月NCBI介紹：NCBI建立在1988年,作為一種公共分子生物學(xué)信息資源,而創(chuàng)建的公開數(shù)據(jù)庫。NCBI的計(jì)劃：1.基本研究；2.數(shù)據(jù)庫；3.軟件的開發(fā)；4.教育和訓(xùn)練第9頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月現(xiàn)在我們以查找甘薯異戊烯氯喹異構(gòu)酶（Ipomoeabatatasisopentenyldiphosphateisomerase，ipi）的編碼序列為例，介紹如何從ＮＣＢＩ中在線獲取所需要的核酸序列．應(yīng)用舉例第10頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月1.進(jìn)入第11頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月2.選擇數(shù)據(jù)庫3.查詢關(guān)鍵詞4.開始查詢第12頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月顯示格式符合條件的記錄數(shù)每頁顯示數(shù)目第13頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月相關(guān)記錄點(diǎn)擊進(jìn)入第14頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月Genbank格式的序列記錄第15頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月第16頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月FASTA格式的序列記錄第17頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月基因表達(dá)的

ORF分析第18頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月

aagcaagacgccaagggccaaggctggctgcaagaagcaaagaggaacgaacactgtgaa61tatcccaatgtcgatgatggcttctgttcaaatctgtcggagattctctcccctagtcgc121ccggccggcgatttactctgccaattcttcattcctctcaccagtctctttcgcctcttc181ttctctttcaattatgccgatccgcctccgctgcagagcttcagtacactctgtccgcgc241cgcctccaccatgggggacaccatcactgatgccaacatggatgctgtccagcgccgcct301catgtttgacgacgagtgtattttggtggatgagaatgaccgtgttgttggtcatgatac361caagtataattgtcatcttatggagaagattgaatctgagaatctgcttcacagagcttt421cagtgttttcttatttaattcaaactatgagttgcttcttcagcaacgatctgcgacaaa481ggtcaccttccctttggtgtggactaacacctgctgcagccatcctctgtaccgggagtc541tgagttgattgaagagaatgctcttggtgtgaggaatgctgcacaaagaaagcttcttga601tgaactggggattcctgcagaggatgtcccagttgatgaattcacaacattgggccgtat661cctgtataaagcaccttctgatgggagatggggagagcatgaacttgattatcttctctt721cattgtgagggatgttggcatgcacccaaacccggatgaggttgcagatgttaaatatgt781gaatagggaacagctgaaagagatcttgaggaaagcaaatgctggagaggatggtataaa841gctttccccttggttcagattagtcgtcgaaaatttcttgttcaaatggtgggatcatgt901cgagaaaggcaccctaatggaagctgcagatatgaaaaccattcacaagttggcctaaac961agccattggctgagcttttgttaaacccttacatctaccattcacttaactgagcaaaaa1021tatattctatggtcttctgcttagtttcatgcttcatgcttgaactttcaagttttatgt1081tacttttggctgttaggaactagtaatatatgtgaacttgctatcaaaaaaaaaaaaaaa1141aaaaaaaaaaaaaaa//第19頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月基因表達(dá)的ORF分析利用計(jì)算機(jī)和互聯(lián)網(wǎng)，對(duì)核酸序列的所有相位進(jìn)行搜索可以很快地獲得ＯＲＦ結(jié)果。國際互聯(lián)網(wǎng)上的ＯＲＦ分析資源有：/gorf/查找);http://expasy.hcuge.ch/www/dna.html(將ＤＮＡ翻譯為蛋白質(zhì))。第20頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月第21頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月第22頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月第23頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月第24頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸序列的

比對(duì)分析第25頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月對(duì)核酸序列的首要分析是聯(lián)網(wǎng)進(jìn)行序列的同源性分析，以便能夠利用最新的數(shù)據(jù)庫反映該序列是否是已知序列以及與已知序列同源性的高低。典型的分析是采用NCBI的BLAST軟件對(duì)GENBANK中的非冗余數(shù)據(jù)庫（non-redundantdatabase,nr）進(jìn)行查詢。該數(shù)據(jù)庫是對(duì)GENBANK、EMBL和DDBJ中去除所有相同核酸序列進(jìn)行整合后所得到的最為全面的已知基因數(shù)據(jù)庫，其中還包括了部分基因組的序列。第26頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月運(yùn)行時(shí)聯(lián)網(wǎng)至：/BLAST按照提示進(jìn)行查詢。第27頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月ggggtcgagtccgcgtccacccgcgagtacaaccttcttgcagctcctccgtcgccggtc61cacacccgccaccagttcgccatggatgacgatatcgctgcgctcgtcgtcgacaacggc121tccggcatgtgcaaggccggcttcgcgggcgacgatgctccccgggccgtcttcccctcc181atcgtgggccgccctaggcaccagggtgtgatggtgggtatgggtcagaaggactcctac241gtgggcgacgaggcccagagcaagagaggcatcctgaccctgaagtaccccattgaacac301ggcattgtcaccaactgggacgatatggagaagatttggcaccacactttctacaatgag361ctgcgtgtggcccctgaggagcaccctgtgctgctcaccgaggcccctctgaaccctaag421gccaaccgtgaaaagatgacccagatcatgtttgagaccttcaacaccccagccatgtac481gtagccatccaggctgtgttgtccctgtatgcctctggtcgtaccactggcattgtgatg541gactccggagacggggtcacccacactgtgcccatctatgagggttacgcgctccctcat601gccatcctgcgtctggacctggctggccgggacctgacagactacctcatgaagatcctg661accgagcgtggctacagcttcaccaccacagctgagagggaaatcgtgcgtgacattaaa721gagaagctgtgctatgttgccctagacttcgagcaagagatggccactgccgcatcctct781tcctccctggagaagagctatgagctgcctgacggtcaggtcatcactatcggcaatgag841cggttccgatgccccgaggctctcttccagccttccttcctgggtatggaatcctgtggc901atccatgaaactacattcaattccatcatgaagtgtgacgttgacatccgtaaagacctc961tatgccaacacagtgctgtctggtggcaccaccatgtacccaggcattgctgacaggatg1021cagaaggagattactgccctggctcctagcaccatgaagatcaagatcattgctcctcct1081gagcgcaagtactctgtgtggattggtggctctatcctggcctcactgtccaccttccag1141cagatgtggatcagcaagcaggagtacgatgagtccggcccctccatcgtgcaccgcaaa1201tgcttctaggcggactgttactgagctgcgttttacaccctttctttgacaaaacctaac1261ttgcgcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa//第28頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月點(diǎn)擊第29頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月第30頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月第31頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月第32頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月第33頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月第34頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月第35頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月第36頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月點(diǎn)擊第37頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月第38頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR引物設(shè)計(jì)第39頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR基本原理Mg2+AGGCTTAAGGGCATAGTAGGC-5’3’-TAATCCCGATTATCCCGT-3’AGGCCCCGTTTAACCCGTTTAATA5’--3’3’--5’AGGCTTAAGGGCATAGTAGGC5’-3’--5’CCCGTTTAACCCGTTTAACCGTA-3’TAATTA-3’5’-3’-TTAAGGGCATTAAGGGCATAGGC-5’80℃60℃40℃30℃50℃72℃90℃94℃TTAAGGGCATAGTACCCGATTATCCCGT5’-第40頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月因此，引物設(shè)計(jì)是整個(gè)工作的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。第41頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月引物設(shè)計(jì)的原則1.引物的長度一般為15-30bp，常用的是18-27bp，但不應(yīng)大于38bp2.引物3’端出現(xiàn)3個(gè)以上的連續(xù)堿基，特別是GGG

或CCC第42頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月引物設(shè)計(jì)的原則3.引物3’端的末位堿基對(duì)Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯(cuò)配位置導(dǎo)致不同的擴(kuò)增效率，末位堿基為A的錯(cuò)配效率明顯高于其他3個(gè)堿基。

4.5’端序列對(duì)PCR影響不太大，因此常用來引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物。

5.引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗。第43頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月引物二聚體Mg2+CGTATTAAGGGCATTAAGGGCATAGGCGAATMg2+-3’-3’3’-5’--5’TAATDNA聚合酶TAATCATT80℃60℃40℃30℃50℃72℃90℃94℃CATT第44頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月引物二聚體Mg2+CGTATTAAGGGCATTAAGGGCATAGGCGAATMg2+-3’-3’3’-5’--5’TAATDNA聚合酶TAATCATT80℃60℃40℃30℃50℃72℃90℃94℃CATT第45頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月引物二聚體Mg2+CGTATTAAGGGCATTAAGGGCATAGGCGAATMg2+-3’-3’3’-5’--5’TAATDNA聚合酶TAATCATT80℃60℃40℃30℃50℃72℃90℃94℃CATT第46頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月發(fā)夾結(jié)構(gòu)5’３’５’３’第47頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月引物設(shè)計(jì)的原則

引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過高:?G≧4.5kcal/mol產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應(yīng)效率降低。

第48頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月引物設(shè)計(jì)的原則6.引物序列的GC含量一般為40-60%，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。第49頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月7.引物所對(duì)應(yīng)模板位置序列的Tm值在72℃左右可使復(fù)性條件最佳。

Tm值的計(jì)算公式:

Tm＝4(G+C)＋2(A+T)引物設(shè)計(jì)的原則第50頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月引物設(shè)計(jì)的原則8.?G值是指DNA雙鏈形成（或者打開）所需的自由能，該值反映雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)選用3’端?G值較低（絕對(duì)值不超過9），而5’端和中間?G值相對(duì)較高的引物。引物的3’端的?G值過高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)。第51頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月這么多要求煩死人了，我抗議！除非……第52頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月常用的引物設(shè)計(jì)軟件Oligo6（引物評(píng)價(jià)）*PremierPrimer（自動(dòng)搜索）*VectorNTISuitDnasisOmigaDnastarPrimer3（在線服務(wù)）*第53頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月常用的引物設(shè)計(jì)軟件PrimerPrimer5.0

的使用技巧簡介1、軟件安裝與主要功能介紹2、引物設(shè)計(jì)應(yīng)用舉例第54頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月常用的引物設(shè)計(jì)軟件我們可以通過網(wǎng)上下載或其它方式獲得安裝軟件1、軟件安裝與主要功能介紹第55頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月2、引物設(shè)計(jì)應(yīng)用舉例引物分類：按PCR目的不同可分為檢測引物和克隆引物兩大類.常用的引物設(shè)計(jì)軟件檢測性引物特點(diǎn):反應(yīng)靈敏性、擴(kuò)增特異性克隆性引物特點(diǎn):產(chǎn)物完整性和保真性第56頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR引物設(shè)計(jì)應(yīng)用舉例

1ctgcaggccactggttaccgggaattgttccggtcaacgcggtattaggtggcgcgctga61gctatctgatccttaacccgattttgaatcgtaaaacgacagcagcaatgacgcatgtgg121aggctaacag

tgtcgaataacgctttacaaacaattattaacgcccggttaccaggcgaa181gaggggctgtggcagattcatctgcaggacggaaaaatcagcgccattgatgcgcaatcc241ggcgtgatgcccataactgaaaacagcctggatgccgaacaaggtttagttataccgccg301tttgtggagccacatattcacctggacaccacgcaaaccgccggacaaccgaactggaat361cagtccggcacgctgtttgaaggcattgaacgctgggccgagcgcaaagcgttattaacc421catgacgatgtgaaacaacgcgcatggcaaacgctgaaatggcagattgccaacggcatt481cagcatgtgcgtacccatgtcgatgtttcggatgcaacgctaactgcgctgaaagcaatg541ctggaagtgaagcaggaagtcgcgccgtggattgatctgcaaatcgtcgccttccctcag601gaagggattttgtcgtatcccaacggtgaagcgttgctggaagaggcgttacgcttaggg661gcagatgtagtgggggcgattccgcattttgaatttacccgtgaatacggcgtggagtcg721ctgcataaaaccttcgccctggcgcaaaaatacgaccgtctcatcgacgttcactgtgat781gagatcgatgacgagcagtcgcgctttgtcgaaaccgttgctgccctggcgcaccatgaa841ggcatgggcgcgcgagtcaccgccagccacaccacggcaatgcactcctataacggggcg901tatacctcacgcctgttccgcttgctgaaaatgtccggtattaactttgtcgccaacccg961ctggtcaatattcatctgcaaggacgtttcgatacgtatccaaaacgtcgcggcatcacg1021cgcgttaaagagatgctggagtccggcattaacgtctgctttggtcacgatgatgtcttc1081gatccgtggtatccgctgggaacggcgaatatgctgcaagtgctgcatatggggctgcat1141gtttgccagttgatgggctacgggcagattaacgatggcctgaatttaatcacccaccac1201agcgcaaggacgttgaatttgcaggattacggcattgccgccggaaacagcgccaacctg1261attatcctgccggctgaaaatgggtttgatgcgctgcgccgtcaggttccggtacgttat1321tcggtacgtggcggcaaggtgattgccagcacacaaccggcacaaaccaccgtatatctg1381gagcagccagaagccatcgattacaaacgt

tgaacgactgggttacagcgagcttagttt1441atgccggatgcggcgtgaacgccttatccggcctacgtagagcactgaactcgtaggcct1501gataagcgtagcgcatcaggcaattccagccgctgatctgtgtcagcggctaccgtgatt1561cattcccgccaacaaccgcgcattcctccaacgccatgtgcaaaaatgccttcgcagcgg1621ctgtctgccagctg1634第57頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月檢測引物設(shè)計(jì)操作第58頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023