高效液相色譜分析學時第1頁，課件共69頁，創作于2023年2月主要內容3-1HPLC的發展3-2HPLCE與經典液相色譜法和GC的差異3-3液相色譜法的原理和特點3-4高效液相色譜的分類和原理3-5液相色譜儀3-6液相色譜的固定相與流動相3-7影響分離的因素與操作條件的選擇第2頁，課件共69頁，創作于2023年2月

3-1HPLC的發展

(HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC)

第3頁，課件共69頁，創作于2023年2月

高效液相色譜法（HPLC）是20世紀60年代末70年代初發展起來的一種新型分離分析技術，隨著不斷改進與發展，目前已成為應用極為廣泛的化學分離分析的重要手段。它是在經典液相色譜基礎上，引入了氣相色譜的理論，在技術上采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測器，因而具備速度快、效率高、靈敏度高、操作自動化的特點。第4頁，課件共69頁，創作于2023年2月

現代液相色譜和經典液相色譜沒有本質的區別。不同點僅僅是現代液相色譜比經典液相色譜有較高的效率和實現了自動化操作。經典的液相色譜法，流動相在常壓下輸送，所用的固定相柱效低，分析周期長。而現代液相色譜法引用了氣相色譜的理論，流動相改為高壓輸送;色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經典液相色譜（每米塔板數可達幾萬或幾十萬）；同時柱后連有高靈敏度的檢測器，可對流出物進行連續檢測。因此，高效液相色譜具有分析速度快、分離效能高、自動化等特點?，F代液相色譜第5頁，課件共69頁，創作于2023年2月3-2HPLCE與經典液相色譜法和GC的差異第6頁，課件共69頁，創作于2023年2月

1．高效液相色譜法與經典液相色譜法

高效液相色譜法比起經典液相色譜法的最大優點在于高速、高效、高靈敏度、高自動化。高速是指在分析速度上比經典液相色譜法快數百倍。由于經典色譜是重力加料，流出速度極慢；而高效液相色譜配備了高壓輸液設備，流速最高可達103cm·min-1.

對氨基酸分離，用經典色譜法，柱長約170cm，柱徑0.9cm，流動相速度為30cm3·h-1，需用20多小時才能分離出20種氨基酸；而用高效液相色譜法，只需lh之內即可完成。又如用25cm×0.46cm的Lichrosorb－ODS(5μ)的柱，采用梯度洗脫，可在不到0.5h內分離出尿中104個組分.第7頁，課件共69頁，創作于2023年2月經典液相色譜法高效液相色譜法（分析型）固定相一般規格特殊規格固定相粒度（μm）75~5003~20固定相粒度分布(RSD)20~30%<5%柱長（cm）10~10010~30柱內徑（cm）2~50.1~0.5柱入口壓強（kg/cm2）0.01~120~300柱效(每米理論塔片數)10~100104~105樣品用量（g）1~1010-7~10-2分析所需時間（h）1~200.05~0.5裝置非儀器化儀器化第8頁，課件共69頁，創作于2023年2月氣相色譜法對揮發性樣品是非常有效的分離方法．但是，對分子量超過300的組分及熱分解產品都不適用．由于樣品在工作溫度下必須汽化這個特點限制了它的應用．為此，人們不得不通過柱前衍生法使樣品能夠汽化，這樣大大加重了分析前處理的復雜性和數據的準確性．而高效液相色譜只需要樣品能制成溶液，不需汽化，不受樣品揮發性的限制．特別適用于高分子化合物，易熱降解的物質及生物活性物質的分離，因此應用面比氣相色譜要高得多．2．高效液相色譜法與氣相色譜法第9頁，課件共69頁，創作于2023年2月氣相色譜（GC）高效液相色譜（HPLC）應用范圍占有機物的20%占有機物的80%分離效果高更高選擇性流動相是氣體，只能選擇固定相流動相是液體，流動相、固定相都可選擇。選擇性廣。溫度高溫常溫（分離效果好）靈敏度(g/ml)10-12

10-9

第10頁，課件共69頁，創作于2023年2月項目高效液相色譜法氣相色譜法進樣方式樣品制成溶液樣品需氣化或裂解流動相溶液惰性氣體分離原理吸附、分配、篩析、親和等吸附和分配檢測器UVD、PDAD、RID等TCD、FID、ECD等應用范圍低、中、高沸點有機化合物離子型無機化合物熱不穩定化合物生物活性分子低沸點有機化合物永久性氣體第11頁，課件共69頁，創作于2023年2月

總之，高效液相色譜法是吸取了氣相色譜與經典液相色譜優點，并用現代化手段加以改進，因此得到迅猛的發展。目前高效液相色譜法已被廣泛應用于分析對生物學和醫藥上有重大意義的大分子物質，例如蛋白質、核酸、氨基酸、多糖類、植物色素、高聚物、染料及藥物等物質的分離和分析。高效液相色譜法的儀器設備費用昂貴，操作嚴格，這是它的主要缺點。第12頁，課件共69頁，創作于2023年2月3-3液相色譜法的原理和特點第13頁，課件共69頁，創作于2023年2月液相色譜分離原理原理：

被分離混合物由流動相液體推動進入色譜柱。根據各組分在固定相及流動相中的吸附能力、分配系數、離子交換作用或分子尺寸大小的差異進行分離。色譜分離的實質是樣品分子（溶質）與溶劑（即流動相或洗脫液）以及固定相分子間的作用，作用力的大小，決定色譜過程的保留行為。

液相色譜的固定相可以是吸附劑、化學鍵合固定相（或在惰性載體表面涂上一層液膜）、離子交換樹脂或多孔性凝膠；流動相是各種溶劑第14頁，課件共69頁，創作于2023年2月液相色譜分離原理根據分離機制不同，液相色譜可分為：

液固吸附色譜液液分配色譜化合鍵合色譜離子交換色譜分子排阻色譜等類型第15頁，課件共69頁，創作于2023年2月特點：高壓——壓力可達150～350x105Pa。色譜柱每米降壓為75kg/cm2以上。高速——流速為0.1～10.0mL/min。高效——塔板數可達5000/米。在一根柱中同時分離成份可達100種。高靈敏度——紫外檢測器靈敏度可達0.01ng。同時消耗樣品少。色譜柱可反復使用——用一根色譜柱可分離不同的化合物。樣品量少，容易回收——樣品經過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。

高沸點、熱不穩定有機及生化試樣的高效分離分析方法。第16頁，課件共69頁，創作于2023年2月3-4高效液相色譜的分類和原理第17頁，課件共69頁，創作于2023年2月1、液-固吸附色譜

固定相：固體吸附劑為，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑；

流動相：各種不同極性的一元或多元溶劑。

基本原理：組分在固定相吸附劑上的吸附與解吸；適用于分離相對分子質量中等的油溶性試樣，對具有官能團的化合物和異構體有較高選擇性；

缺點：非線形等溫吸附常引起峰的拖尾；第18頁，課件共69頁，創作于2023年2月固定相：與LC比，固定相粒徑不同（<10μm）

（2）高分子多孔小球：YSG

原理：吸附+分配蒹小孔凝膠作用特點：柱選擇性好，峰形好，柱效低適用：分離弱極性化合物（1）硅膠表孔硅膠（薄殼硅膠）全多孔硅膠無定形YWG5~6μm5×104

球形YQG3~4μm8×108

堆積硅珠YQG3~4μm8×108

理想

原理：吸附特點：峰易拖尾適用：分離極性化合物第19頁，課件共69頁，創作于2023年2月流動相：底劑（烷烴）+有機極性調節劑

例：正己烷或庚烷+氯仿---1．影響k的因素：與固定相性質和流動相性質有關溶質分子極性↑，洗脫能力↓，k↑，tR↑

溶劑系統極性↑，洗脫能力↑，k↓，tR↓注：調節溶劑極性，可以控制組分的保留時間2．出柱順序：強極性組分后出柱，弱極性組分先出柱3．硅膠吸水量↑，LSC→LLC硅膠含水量較小吸附色譜硅膠極性較大硅膠含水量>17%分配色譜硅膠失活→載體吸附的水→固定液第20頁，課件共69頁，創作于2023年2月2、液-液分配色譜

固定相與流動相均為液體（互不相溶）；

基本原理：組分在固定相和流動相上的分配；

流動相：對于親水性固定液，采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定液的極性（正相normalphase），反之，流動相的極性大于固定液的極性（反相reversephase）。正相與反相的出峰順序相反；

固定相：早期涂漬固定液，固定液流失，較少采用；

化學鍵合固定相：（將各種不同基團通過化學反應鍵合到硅膠（擔體）表面的游離羥基上。C-18柱（反相柱）。第21頁，課件共69頁，創作于2023年2月（1）分離機制：利用組分在兩相中溶解度的差異（2）固定相：載體+固定液（物理或機械涂漬法）缺點：系統內部壓力大，易流失，不實用

固定液——極性→正相

固定液——非極性→反相

（3）正相色譜——固定液極性>流動相極性（正相

）

極性小的組分先出柱，極性大的組分后出柱適于分離極性組分

反相色譜——固定液極性<流動相極性（反相

）

極性大的組分先出柱，極性小的組分后出柱適于分離非極性組分第22頁，課件共69頁，創作于2023年2月利用化學反應將固定液的官能團鍵合在載體表面

分離機制：分配+吸附（以LLC為基礎）

特點：不易流失熱穩定性好化學性能好載樣量大適于梯度洗脫（4）化學鍵合固定相第23頁，課件共69頁，創作于2023年2月3、離子交換色譜

離子色譜是在20世紀70年代中期發展起來的一種技術，其與離子交換色譜的區別是其采用了特制的、具有極低交換容量的離子交換樹脂作為柱填料，并采用淋洗液抑制技術和電導檢測器，是測定混合陰離子的有效方法。第24頁，課件共69頁，創作于2023年2月離子交換色譜

固定相：陰離子離子交換樹脂或陽離子離子交換樹脂；

流動相：陰離子離子交換樹脂作固定相，采用酸性水溶液；陽離子離子交換樹脂作固定相，采用堿性水溶液；

基本原理：組分在固定相上發生的反復離子交換反應；組分與離子交換劑之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關。親和力大，保留時間長；

陽離子交換：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+

陰離子交換：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-

應用：離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等。第25頁，課件共69頁，創作于2023年2月第26頁，課件共69頁，創作于2023年2月離子色譜圖第27頁，課件共69頁，創作于2023年2月離子色譜的應用

陰離子分析:

雙柱；薄殼型陰離子交換樹脂分離柱(3×250mm),

流動相：0.003mol·L-1NaHCO3/0.0024mol·L-1Na2CO3，流量138mL/hr。七種陰離子在20分鐘內基本上得到完全分離，各組分含量在3～50ppm。第28頁，課件共69頁，創作于2023年2月3-5液相色譜儀第29頁，課件共69頁，創作于2023年2月第30頁，課件共69頁，創作于2023年2月第31頁，課件共69頁，創作于2023年2月第32頁，課件共69頁，創作于2023年2月第33頁，課件共69頁，創作于2023年2月液相色譜法流程及主要部件流程第34頁，課件共69頁，創作于2023年2月第35頁，課件共69頁，創作于2023年2月優化流路減小死體積流路自上而下堆積配置手持控制器檢測器

柱溫箱自動進樣器泵脫氣機

溶劑柜第36頁，課件共69頁，創作于2023年2月各部分組成簡介一、高壓輸液系統由溶劑貯存器、高壓泵、梯度洗脫裝置和壓力表等組成。二、進樣系統包括進樣口、注射器和進樣閥等，它的作用是把分析試樣有效地送入色譜柱上進行分離。三、分離系統包括色譜柱、恒溫器和連接管等部件。色譜柱一般用內部拋光的不銹鋼制成。其內徑為2~6mm，柱長為10~50cm，柱形多為直形，內部充滿微粒固定相。柱溫一般為室溫或接近室溫。四、檢測器是液相色譜儀的關鍵部件之一。對檢測器的要求是：靈敏度高，重復性好、線性范圍寬、死體積小以及對溫度和流量的變化不敏感等。第37頁，課件共69頁，創作于2023年2月

由于高效液相色譜所用固定相顆粒極細，因此對流動相阻力很大，為使流動相較快流動，必須配備有高壓輸液系統。它是高效液相色譜儀最重要的部件，一般由儲液罐、高壓輸液泵、過濾器、壓力脈動阻力器等組成，其中高壓輸液泵是核心部件。

1、高壓輸液泵第38頁，課件共69頁，創作于2023年2月

對于一個好的高壓輸液泵應符合密封性好，輸出流量恒定，壓力平穩，可調范圍寬，便于迅速更換溶劑及耐腐蝕等要求。常用的輸液泵分為恒流泵和恒壓泵兩種：（1）恒流泵特點是在一定操作條件下，輸出流量保持恒定而與色譜柱引起阻力變化無關；（2）恒壓泵是指能保持輸出壓力恒定，但其流量則隨色譜系統阻力而變化，故保留時間的重視性差，它們各有優缺點。目前恒流泵正逐漸取代恒壓泵。第39頁，課件共69頁，創作于2023年2月第40頁，課件共69頁，創作于2023年2月2、洗脫方式

1）等度洗脫（恒組成溶劑洗脫）以固定配比的溶劑系統洗脫組分（一個泵）類似GC的等溫度洗脫2）梯度洗脫：在一定分析周期內不斷變換流動相的種類和比例即不斷改變其極性（兩個泵）適于分析極性差別較大的復雜組分類似GC的程序升溫（沸程較長樣品）第41頁，課件共69頁，創作于2023年2月梯度淋洗裝置外梯度:利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進入色譜柱。內梯度:一臺高壓泵,通過比例調節閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。第42頁，課件共69頁，創作于2023年2月梯度淋洗程序0～10分鐘：流動相A（％）：30→35；流動相B（％）：70→65

10～21分鐘：流動相A（％）：35→50；流動相B（％）：65→50

21～26分鐘：流動相A（％）：50；流動相B（％）：50

第43頁，課件共69頁，創作于2023年2月3、進樣裝置

流路中為高壓力工作狀態，通常使用耐高壓的六通閥進樣裝置，其結構如圖所示：第44頁，課件共69頁，創作于2023年2月第45頁，課件共69頁，創作于2023年2月4、高效分離柱

柱體為直型不銹鋼管，內徑1～6mm，柱長5～40cm。發展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。第46頁，課件共69頁，創作于2023年2月

（1）色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括柱管與固定相兩部分。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內襯光滑的聚合材料的其他金屬。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。（2）一般色譜柱長5～30cm，內徑為4～5mm，凝膠色譜柱內徑3～12mm，制備往內徑較大，可達25mm以上。

第47頁，課件共69頁，創作于2023年2月

（3）一般在分離前備有一個前置柱，前置柱內填充物和分離柱完全一樣，這樣可使淋洗溶劑由于經過前置柱為其中的固定相飽和，使它在流過分離柱時不再洗脫其中固定相，保證分離技的性能不受影響。（4）柱子裝填得好壞對柱效影響很大。對于細粒度的填料（＜20μm）一般采用勻漿填充法裝柱，先將填料調成勻漿，然后在高壓泵作用下，快速將其壓入裝有洗脫液的色譜柱內，經沖洗后，即可備用。第48頁，課件共69頁，創作于2023年2月5、液相色譜檢測器（1）紫外檢測器應用最廣，對大部分有機化合物有響應。特點：

靈敏度高；線形范圍高；流通池可做的很?。?mm×10mm，容積8μL）；對流動相的流速和溫度變化不敏感；波長可選，易于操作；可用于梯度洗脫。

第49頁，課件共69頁，創作于2023年2月(2)熒光檢測器

高靈敏度、高選擇性；對多環芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應；光電二極管陣列檢測器示差折光檢測器

第50頁，課件共69頁，創作于2023年2月3-6液相色譜的固定相與流動相第51頁，課件共69頁，創作于2023年2月固定相1.液-液分配及離子對分離固定相

（1）全多孔型擔體（2）表面多孔型擔體（3）化學鍵合固定相2.液-固吸附分離固定相

種類：硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等；結構類型：全多孔型和薄殼型3.離子交換色譜分離固定相

（1）薄殼型離子交換樹脂（2）離子交換鍵合固定相4.空間排阻分離固定相（1）軟質凝膠

（2）半硬質凝膠（3）硬質凝膠

第52頁，課件共69頁，創作于2023年2月1.液-液分配及離子對分離固定相在液液色譜中，一個液相作為流動相，而另一個液相則涂漬在很細惰性載體或硅膠上作為固定相。流動相與固定相應互不相溶，兩者之間應有一明顯的分界面。液液色譜的固定相由載體和固定液組成。載體由硅膠、硅藻土等材料制成。而固定液有，—氧二丙腈（ODPN），聚乙二醇（PEG），十八烷（ODS）和角鯊烷固定液等。流動相：當選擇固定液是極性物質時，所選用的流動相通常是極性很小的溶劑或非極性溶劑。第53頁，課件共69頁，創作于2023年2月

（1）全多孔型擔體

由氧化硅、氧化鋁、硅藻土等制成的多孔球體；早期采用100μm的大顆粒，表面涂漬固定液，性能不佳已不多見；現采用10μm以下的小顆粒，化學鍵合制備柱填料；

（2）表面多孔型擔體（薄殼型微珠擔體）

30～40μm的玻璃微球，表面附著一層厚度為1～2μm的多孔硅膠。表面積小，柱容量底；第54頁，課件共69頁，創作于2023年2月（3）化學鍵合固定相

化學鍵合固定相:目前應用最廣、性能最佳的固定相；

a.硅氧碳鍵型：≡Si—O—C

b.硅氧硅碳鍵型：≡Si—O—Si—

C

穩定，耐水、耐光、耐有機溶劑，應用最廣；

c.硅碳鍵型：≡Si—Cd.硅氮鍵型：≡Si—N第55頁，課件共69頁，創作于2023年2月化學鍵合固定相的特點（1）傳質快，表面無深凹陷，比一般液體固定相傳質快；（2）壽命長，化學鍵合，無固定液流失，耐流動相沖擊；耐水、耐光、耐有機溶劑，穩定；（4）選擇性好，可鍵合不同官能團，提高選擇性；（5）有利于梯度洗脫；

存在著雙重分離機制：(鍵合基團的覆蓋率決定分離機理)高覆蓋率：分配為主；低覆蓋率：吸附為主；

第56頁，課件共69頁，創作于2023年2月

2.液-固吸附分離固定相

種類：硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等；結構類型：全多孔型和薄殼型；粒度：5～10μm；

第57頁，課件共69頁，創作于2023年2月3.離子交換色譜分離固定相

結構類別：（1）薄殼型離子交換樹脂薄殼玻璃珠為擔體，表面涂約1%的離子交換樹脂；（2）離子交換鍵合固定相薄殼鍵合型；微粒硅膠鍵合型（鍵合離子交換基團）樹脂類別：（1）陽離子交換樹脂（強酸性、弱酸性）（2）陰離子交換樹脂（強堿性、弱堿性）第58頁，課件共69頁，創作于2023年2月流動相

流動相特性（1）液相色譜的流動相又稱為：淋洗液，洗脫劑。流動相組成改變，極性改變，可顯著改變組分分離狀況；（2）親水性固定液常采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正相柱。（3）若流動相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。第59頁，課件共69頁，創作于2023年2月流動相由于高效液相色譜中流動相是液體，它對組分有親合力，并參與固定相對組分的競爭，因此，正確選擇流動相直接影響組分的分離度對流動相溶劑的要求是：（1）溶劑對于待測樣品，必須具有合適的極性和良好的選擇性。（2）溶劑與檢測器匹配。對于紫外吸收檢測器，應注意選用檢測器波長比溶劑的紫外截止波長

要長。第60頁，課件共69頁，創作于2023年2月（3）高純度由于高效液相色譜靈敏度高，對流動相溶劑的純度也要求高。不純的溶劑會引起基線不穩或產生“偽峰”。（4）化學穩定性好（5）低粘度（粘度適中）若使用高粘度溶劑，勢必增高壓力，不利于分離。常用的低粘度溶劑有丙酮、甲醇和乙腈等；但粘度過低的溶劑也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它們容易在色譜柱或檢測器內形成氣泡，影響分離。第61頁，課件共69頁，創作于2023年2月流動相類別

按流動相組成分：單組分和多組分；

按極性分：極性、弱極性、非極性；

按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。

常用溶劑：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調節流動相的極性或增加選擇性，以改進分離或調整出峰時間。第62頁，課件共69頁，創作于2023年2月流動相選擇

在選擇溶劑時，溶劑的極性是選擇的重要依據。采用正相液-液分配分離時：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時間太短，降低溶劑極性，反之增加。也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保留時間縮短。

常用溶劑的極性順序：水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>