第四章DNA的復制

Chapter4DNAReplication2020/11/241第四章DNA復制

DNAReplication1引言---基因組復制與細胞分裂的關系2復制子3DNA復制的幾種形式4DNA聚合酶5原核生物DNA復制的基本過程6真核生物DNA復制7DNA復制的調控8小結2020/11/242精品資料3你怎么稱呼老師？如果老師最后沒有總結一節課的重點的難點，你是否會認為老師的教學方法需要改進？你所經歷的課堂，是講座式還是討論式？教師的教鞭“不怕太陽曬，也不怕那風雨狂，只怕先生罵我笨，沒有學問無顏見爹娘……”“太陽當空照，花兒對我笑，小鳥說早早早……”4重點內容：

①幾個重要概念：DNA的復制、復制子、復制眼、復制叉、DNA聚合酶、DNA的半保留復制、DNA的半不連續復制、DNA的先導鏈、DNA的后隨鏈、岡崎片段；②不同生物基因組復制子數目；③線性DNA復制末端問題的提出及解決方案；④θ-復制、滾環復制及D-環復制的機制；⑤大腸桿菌DNA聚合酶I、II、III的性質比較，DNA聚合酶Ⅰ與缺口平移法制備探針；⑥DNA復制的起始、延伸及終止。了解內容：

①基因組復制與細胞分裂的關系；②復制叉移動方向的確定；真核生物DNA聚合酶的種類及各自的功能；③DNA復制的調控。

2020/11/2451引言---基因組復制與細胞分裂的關系細胞在每次分裂的過程中，整個基因組都必須精確地復制一次。如何保證這一點？兩個原則(1)DNA復制的啟動決定了細胞的進一步分裂;(2)復制過程完成前，細胞是不會發生分裂的。2020/11/2462復制子(replicon)2.1復制子的定義2.2不同生物復制子的數目2.3復制眼概念2.4復制叉概念及其移動方向的實驗確定2.5復制的模式---起點、方向和速度2020/11/2472.1復制子的定義DNA中發生一次復制的單位稱為復制子(replicon)。復制子是根據它含有復制所需的控制元件來定義的，在復制啟動位點具起始點（origin)，在復制終止位點具終點（terminus)。起始點僅作用于所在復制子。

注：在每個細胞周期中，每個復制子發生一次復制，且只發生一次。2020/11/248質粒一般是一個自主環狀的DNA基因組，構成一個獨立復制子；原核生物基因組中一般只含一個復制子，在唯一的起始點啟動就會引起整個基因組復制；真核生物基因組含多個復制子（一般40-100kb/個）。

2.2不同生物復制子的數目2020/11/2492.3復制眼概念

復制眼：在一個長的未復制區域內DNA已經復制的區域2020/11/2410Replicationeye2020/11/2411復制叉:雙螺旋DNA兩條親本鏈分開使復制能進行的部位。2.4復制叉的概念及其移動方向的確定2020/11/2412復制叉移動方向的確定放射性自顯影法：對于大基因組內的不確定區域，兩次連續的放射脈沖可以用來標記復制的移動。如果一個脈沖比另一個脈沖強，我們可以用相對的標記強度來區分，這些可用放射自顯影觀察。單向復制：在復制眼的一端，一種類型的標記后緊跟著另一種標記；雙向復制：在復制眼的兩端產生一種（對稱的）模式。在真核生物中普遍存在。2020/11/24132.5復制的模式---起點、方向和速度單起點、單方向多起點、單方向單起點、雙方向多起點、雙方向2020/11/24143DNA復制的幾種形式3.1線性DNA雙鏈的復制3.2環狀DNA雙鏈的復制2020/11/24153.1線性DNA雙鏈的復制3.1.1線性DNA復制的具體表現3.1.2線性DNA復制時末端問題的提出3.1.3線性DNA復制時末端問題的解決方案2020/11/24163.1.1線性DNA復制的具體表現2020/11/2417

3.1.2線性DNA復制時末端問題的提出所有已知的核酸聚合酶，無論是DNA聚合酶還是RNA聚合聚合酶都只從5`端向3`端移動，新鏈的合成方向與聚合酶移動方向一致，即只能是5`→3`；而對于DNA的合成必需一段引物的存在，體內DNA復制時，由一段RNA引物起始DNA合成，起始后它必須切除，切除后，5`端如何起始呢？這就提出了線性DNA末端復制的問題。2020/11/24182020/11/2419復制能在新合成鏈的3`端結束，它如何在5`端啟動呢？2020/11/2420

3.1.3線性DNA復制時末端問題的解決方案(1）通過將線性復制子轉變為環狀或多聚分子。如λ噬菌體：滾環產生多聚復制子）；(2）某種蛋白質可能會介入，在真正的末端上啟動。幾種線性病毒核酸具有與5`端堿基共價結合的蛋白質，其中了解最清楚的例子是腺病毒DNA)。(3）DNA可形成特殊的結構，如在末端形成發夾。使分子沒有游離末端。草履蟲（Paramecium）的線性線粒體DNA的復制中就形成了一種交聯；(4）末端是可變的，而不是精確確定的。真核生物染色體可能采用這種方式，在這種情況下，DNA末端的短重復序列的拷貝數改變（如端粒的復制）；2020/11/2421（1）通過將線性復制子轉變為環狀或多聚分子2020/11/2422TherollingcirclereplicatesDNAPhageλ2020/11/2423Arollingcircleappearsasacircularmoleculewithalineartailbyelectronmicroscopy.2020/11/24242020/11/2425Adenovirusterminalproteinbindstothe5`endofDNAandprovidesaC-OHendtoprimesynthesisofanewDNAstrand.（2）某種蛋白質介入而在真正的末端啟動復制2020/11/2426AdenovirusDNAreplicationisinitiatedseparatelyatthetwoendsofthemoleculeandproceedsbystranddisplacement.（3）DNA末端形成特殊結構2020/11/2427AtypicaltelomerehasasimplerepeatingstructurewithaG-T-richstrandthatextendsbeyondtheC-A-richstrand.TheG-tailisgeneratedbyalimiteddegradationoftheC-A-richstrand.（4）末端長度可變2020/11/2428AloopformsattheendofchromosomalDNA.2020/11/2429The3single-strandedendofthetelomere(TTAGGG)ndisplacesthehomologousrepeatsfromduplexDNAtoformat-loop.2020/11/2430Watchingflash2020/11/24313.2環狀DNA的復制3.2.1θ-復制3.2.2滾環復制3.2.3D-環復制2020/11/24323.2.1θ-復制

replicationbyθ-structure2020/11/24333.2.2滾環復制replicationbyrollingcyclesstructureφX174噬菌體由一個單鏈環狀DNA組成，這條鏈稱為正（+）鏈；合成的互補鏈稱為負（一）鏈。雙鏈體的復制以滾環復制方式進行。2020/11/2434TheAproteiniscis-actingPhageφX174Thereplicationbyrollingcyclestructure2020/11/24353.2.3D-環復制Replicationbydisplacementloopstructure2020/11/2436D-環復制（Replicationbydisplacementloopstructure)2020/11/24374DNA聚合酶4.1大腸桿菌DNA聚合酶的種類及其功能4.2真核生物DNA聚合酶的種類及其功能4.3DNA聚合酶所具有的共同結構2020/11/24384.1大腸桿菌DNA聚合酶的種類及其功能SOS修復2020/11/2439性質聚合酶I聚合酶II聚合酶III3`→5`外切+++5`→3`外切+--新生鏈的合成--+生物學活性10.0515生物學功能切除引物修復DNA修復DNA復制4.1.1大腸桿菌DNA聚合酶I、II、III的性質比較2020/11/2440（1）DNA聚合酶I

103kDa的單鏈多肽，可以被蛋白酶切成兩段，C端的2/3包括聚合酶活性位點；N端的1/3包含核酸外切酶校正活性（一次可切除1-10個堿基）。（2）利用DNA聚合酶I進行缺口平移法制備探針的基本原理4.1.2DNA聚合酶I與缺口平移法制備探針2020/11/2441Nicktranslationreplacespartofapre-existingstrandofduplexDNAwithnewlysynthesizedmaterial.DNaseⅠ2020/11/24424.2真核生物DNA聚合酶的種類及其功能2020/11/24432020/11/2444真核生物由不同DNA聚合酶

分別負責起始和延伸三種細胞核DNA復制酶具有不同的功能:DNApolymeraseα起始新鏈合成DNApolymeraseδ延伸先導鏈DNApolymeraseε可能與后隨鏈合成有關，也可能具有其他功能2020/11/24454.3DNA聚合酶所具有的共同結構許多DNA聚合酶有一個由三個結構域組成的大裂隙，類似于手形。2020/11/2446ThecommonorganizationofDNApolymeraseshasapalmthatcontainsthecatalyticsite,fingersthatpositionthetemplate,athumbthatbindsDNAandisimportantinprocessivity,anexonucleasedomainwithitsownactivesite,andanN-terminaldomain.2020/11/24475

原核生物DNA復制的基本過程5.1DNA復制的起始5.2DNA合成鏈的延伸5.3DNA復制的終止2020/11/24485.1.1單鏈DNA的產生5.1.23`-OH引發末端的產生5.1.3復制復合體的形成

5.1DNA復制的起始2020/11/24495.1.1單鏈DNA的產生解旋酶(helicase):使DNA的兩條鏈分開，它通常利用ATP水解來提供必需的能量；2020/11/2450拓撲異構酶（DNATopisomerase）拓撲異構酶的種類分為Ⅰ型和Ⅱ型。原核拓撲構酶Ⅰ：MW=100kD，單肽鏈，含3~4個Zn。作用是暫時切斷一條DNA鏈，形成酶-DNA共價中間物而使超螺旋DNA松弛，然后再將切斷的單鏈DNA連接起來。每次改變一個連環數。2020/11/2451原核拓撲構酶Ⅰ作用機制：①酶與DNA結合使雙鏈解旋；②使一條鏈切開，但酶與切口的兩端結合阻止了螺旋的旋轉；③酶使另一條鏈經過缺口，然后再將兩斷端連接起來；④酶從DNA上脫落，兩條鏈復原，得到的DNA比原來少一個負超螺旋。2020/11/2452拓撲異構酶Ⅱ拓撲異構酶Ⅱ也稱旋轉酶。廣泛存在于各種生物中。使正超螺旋轉化為負超螺旋，每次改變兩個連接數。2020/11/2453ReplicationmachineryreplicationPositivesupercoilBreakDNATopoisomeraseIIpassDNAthroughthebreaknegativesupercoil2020/11/2454單鏈結合蛋白（single-strandbindingprotein):單鏈DNA結合，阻止其再形成雙鏈體狀態φX174噬菌體的DNA在三種功能蛋白先后作用下分開成為單鏈：在復制起始點，噬菌體A蛋白使病毒（+）鏈產生缺口。Rep蛋白提供解旋酶活性，它使兩鏈分離。SSB包繞單鏈形成穩定的單鏈形式。ThreeproteinsunwindφX174DNA2020/11/24555.1.23`-OH引發末端的產生2020/11/2456多種方法可以產生3`-OH末端1)3)2)2020/11/2457起始需要解旋酶、單鏈結合蛋白和引發酶5.1.3復制復合體的形成2020/11/24585.2DNA合成鏈的延伸5.2.1半保留復制合成兩條新的DNA鏈5.2.2DNA的合成是半不連續的5.2.3連接酶將岡崎片段連接在一起5.2.4前導鏈和后隨鏈的協調合成5.2.5DNA復制忠實性的控制

2020/11/2459(1)半保留復制的概念

DNA在復制時，兩條鏈解開分別作為模板，在DNA聚合酶的催化下按堿基互補的原則合成兩條與模板鏈互補的新鏈，以組成新的DNA分子。這樣新形成的兩個DNA分子與親代DNA分子的堿基順序完全一樣。由于子代DNA分子中一條鏈來自親代，另一條鏈是新合成的，這種復制方式稱為半保留復制(semiconsertivereplication)。5.2.1半保留復制合成兩條新的DNA鏈2020/11/2460(2)半保留復制實驗證據（Meselson-Stahl)

1958年Meselson&stahl用同位素（15N）示蹤標記加密度梯度離心技術實驗,該實驗跟蹤了生長了三代的大腸桿菌，證明了DNA是采取半保留的方式進行復制。[15N][15N-14N][14N][15N-14N][15N-14N]2020/11/24615.2.2DNA的合成是半不連續的

（semidiscontinuousreplication)DNA復制在合成先導鏈（leadingstrand)時是連續的；而在合成后隨鏈(laggingstrand)時是先形成小片段（Okazakifragment），隨后再將它們連接而成大片段。因后隨鏈是不連續合成的而先導鏈是連續合成的，所以我們稱之為半不連續復制（semidiscontinuousreplication)。2020/11/2462兩條新鏈具有不同的特征ThetwonewDNAstrandshavedifferentfeaturesOkazakifragment2020/11/24635.2.3連接酶（Ligase)將Okazakifragment連接在一起2020/11/24645.2.4前導鏈(Leadingstrand))和后隨鏈(laggingstrand)的協調合成2020/11/24655.2.5DNA聚合酶控制復制的忠實性2020/11/2466DNA聚合酶造成的復制錯誤可分為兩類：移碼（frameshift):

指一個核