分子分型方法在流行病學調查中的應用細菌的分子分型方法近年來分子生物學技術在各個方面得到廣泛地應用，這些技術滲透到流行病學之中，形成了一門新的分支學科—分子流行病學。分子流行病學中重要的一點是利用合適的分型方法對分離到的病原進行分析。2分子分型方法在流行病學調查中的應用細菌的分子分型方法一種方法是否能應用于分子分型以及其分型效果如何大致可以從以下幾個方面考慮：3分子分型方法在流行病學調查中的應用細菌的分子分型方法1、分型力是指對所分析菌株能夠得到明確的陽性結果的能力。2、重復性是指當重復測試相同菌株時能夠得到相同結果。3、鑒別能力是指區別非相關菌株的能力。理想的分型方法應該能識別每一無關的分析菌株。4、結果易于解釋這是非常重要的。5、快速、廉價、技術簡單。4分子分型方法在流行病學調查中的應用細菌的分子分型方法腸道致病性的分型技術大致如下：1、表現型分型方法。抗生素敏感性噬菌體分型5分子分型方法在流行病學調查中的應用細菌的分子分型方法2、基因分型技術，A質粒圖譜分析B以PCR為基礎的分型方法，如隨機擴增多態性分析法（RAPD）、擴增片段長度多態性（AFLP）；C限制性片段長度多態性（RFLPs）的SouthernBlot分析。D脈沖場凝膠電泳方法（PFGE）。6分子分型方法在流行病學調查中的應用細菌的分子分型方法1、抗生素敏感性試驗抗生素敏感性測試是臨床微生物實驗室常規應用的方法，手工和自動的方法都可以做到，也可以進行嚴格地質量控制。操作簡單，相對經濟。7分子分型方法在流行病學調查中的應用細菌的分子分型方法如果要進行詳盡的流行病學分析，抗生素敏感性試驗資料的用途就相對有限了。這不僅是因為表現型有變種的存在，更是因為現代的醫院中，存在中非常大的抗生素的選擇壓力。一個特定的菌株，可以通過多種遺傳學機制，“突然”對某種抗生素表現出抗性。8分子分型方法在流行病學調查中的應用細菌的分子分型方法另一方面，如果沒有特定的選擇壓力，這些遺傳元件也可以丟失（如R因子）。所以，不同的菌株可能具有相同的抗性圖譜，在患者不同時期分離到的同一種細菌菌株，也可能會表現出不同的抗生素敏感性圖譜。9分子分型方法在流行病學調查中的應用細菌的分子分型方法噬菌體分型分析噬菌體裂解細菌細胞具有一定的特異性。一些噬菌體只能感染一個種或屬的細菌，一些噬菌體可以裂解同一種細菌的不同株。因此，可以利用不同噬菌體的裂解細菌細胞的特異性，可以分離、篩選一組噬菌體，用于傳染源的追蹤和菌株的分析。10分子分型方法在流行病學調查中的應用細菌的分子分型方法缺點是除了一些參比實驗室外，很少實驗室能擁有種類比較完全的噬菌體，在應用方面受到了很大的限制。其次，噬菌體分型技術的要求比較嚴格，需要經驗豐富的工作人員。同時，噬菌體分型常常會遇到多樣性結果，需要仔細推敲。還有，使用認可的噬菌體，許多菌株不能獲得滿意的結果，不得不考慮使用其它噬菌體，給結果的分析帶來困難。11分子分型方法在流行病學調查中的應用細菌的分子分型方法英國把噬菌體分析和PFGE方法結合使用，對E.coliO157：H7大腸桿菌進行分型。可以把E.coliO157：H7大腸桿菌至少分為66個噬菌體型。小腸結腸炎耶爾森菌亦可用噬菌體分型。12分子分型方法在流行病學調查中的應用細菌的分子分型方法基因分型技術質粒圖譜方法最先應用于流行病學研究的以DNA為基礎的技術就包括質粒的分析。分別提取分離菌株的質粒DNA，在瓊脂糖凝膠上電泳分離，測定質粒的數目及大小。該方法簡單經濟，易于推廣。臨床分離的E.coliO157：H7大多數菌株都含有質粒，可以應用質粒圖譜法來進行分型。13分子分型方法在流行病學調查中的應用細菌的分子分型方法然而，細菌的質粒可以自發丟失（如小腸結腸炎耶爾森菌質粒的自然丟失率在10%左右，且這種丟失是不可逆的）、獲得質粒。還可以在細菌之間進行接合轉移，這就使得質粒圖譜分析的結果有時候難以解釋。另一個問題是質粒DNA構型可能發生改變。14分子分型方法在流行病學調查中的應用細菌的分子分型方法此外，使用質粒圖譜分析方法不能夠區分那些分子量相同而DNA序列不同的質粒，或分子量不同而有較高同源性的質粒。針對這一情況，人們把質粒用限制性內切酶消化，再用電泳分析限制性片段的數目和大小，這樣質粒分析的可重復性和分辨力都會得到很大的提高。15分子分型方法在流行病學調查中的應用細菌的分子分型方法基于PCR的分型系統隨機引物PCR（AP-PCR），也就是隨機擴增多態性DNA分析（RAPD）。使用那些不針對任何已知遺傳位點的短引物（通常8-10bp），可以隨機地與染色體DNA結合，并有足夠的親和力啟動聚合酶反應。16分子分型方法在流行病學調查中的應用細菌的分子分型方法然而，在實踐中，用AP-PCR獲得可重復的高分辨力的結果還存在一定的困難。第一，如果條帶的強弱可以證明菌株之間的差異時，我們很難比較和解釋圖譜；第二，由于某些產物可能代表效率相對低的反應，技術因素的微小改變就可以導致不同的擴增反應中一個特定菌株產生的實際片段差別很大。17分子分型方法在流行病學調查中的應用細菌的分子分型方法另外一個影響RAPD可重復性的因素或許是由質粒編碼的片段的擴增，質粒是可以丟失或獲得的，有文獻報道質粒的影響很小。可重復性差是問題，導致了分辨力的降低，極大地妨礙了不同實驗室之間結果的比較。一些報道提出使用固定濃度的純化DNA可以提高可重復性，從而使此方法有了較好的應用，但操作起來很困難很煩瑣。18分子分型方法在流行病學調查中的應用細菌的分子分型方法擴增片段長度多態性分析（AFLP）技術。AFLP的原理：用特異性的酶將細菌染色體組消化之后，對其消化片段進行選擇性擴增。19分子分型方法在流行病學調查中的應用細菌的分子分型方法此技術包括三個步驟：（1）將DNA酶切，并在酶切片段兩端連接上寡聚核苷酸接頭，（2）對一組限制性片段進行選擇性擴增，（3）對擴增片段進行凝膠分析。20分子分型方法在流行病學調查中的應用細菌的分子分型方法其引物是根據接頭和酶切位點的序列來確定的。由于其引物延伸至限制性片段內部，所以只有限制性位點兩側的核苷酸序列與引物延伸端匹配的片段才能被擴增，這樣就實現了選擇性擴增。使用這種方法，在不知道核苷酸序列的情況下，就可以應用PCR觀察到一組限制性片段。21分子分型方法在流行病學調查中的應用細菌的分子分型方法從理論上來講，AFLP可以應用于所有的細菌且重復性和分辨力都好。有報道應用于E.coliO157：H7的分子分型。他們認為，AFLP技術可以作為E.coliO157：H7分子流行病學研究的一種方法。22分子分型方法在流行病學調查中的應用細菌的分子分型方法核糖體分型（Ribotyping）Ribotyping指一種特殊的SouthernBlot分析法。在此方法中，用與核糖體操縱單元有關的RFLP來對菌株進行分析。23分子分型方法在流行病學調查中的應用細菌的分子分型方法總的來說，核糖體分型方法穩定、可重復。在一般情況下，來源于一個暴發的菌株有相同的核糖體型.。然而，流行病學上無相關性的菌株經常有相同的圖譜，這就直接限制了該方法的應用.。24分子分型方法在流行病學調查中的應用核糖體分型（Ribotyping）Ribotyping指一種特殊的SouthernBlot分析法。在此方法中，用與核糖體操縱單元有關的RFLP來對菌株進行分析。在國際上已有完全自動化的儀器，如美國杜邦公司生產的RiboPrinterMicrobialCharacterizationSystem，操作快速簡便，完全排除了人為因素對實驗結果的影響，重復性好結果穩定。25分子分型方法在流行病學調查中的應用其操作過程可簡述為：將純化的細菌培養物用儀器自帶的取樣棒蘸取并加入樣品緩沖液中，置于熱處理器上滅活，然后加入細胞裂解液使細菌DNA釋放。按照操作程序打開儀器，將樣品和試劑放到固定的位置，該儀器便可進行如下的自動操作：酶切→電泳→轉膜，電泳和轉膜同時完成。轉好的膜與結合了化學發光物質的探針結合（雜交），數碼照相系統通過捕獲化學發光物質，對所發出的光進行拍照，這樣我們即可得到最后的結果。26分子分型方法在流行病學調查中的應用我們利用這一系統提供的核糖體基因DNA指紋的相似度值和鑒定結果，便可進行分型。我們利用本系統對我國分離的部分O：3，O：9小腸結腸炎耶爾森菌進行了分型，這種分型基本上和血清型相符合（見圖）。27分子分型方法在流行病學調查中的應用28分子分型方法在流行病學調查中的應用細菌的分子分型方法五、脈沖電場凝膠電泳（PFGE）這一方法在凝膠上外加正交的交變脈沖電場。每當電場方向改變后，大DNA分子便滯留在爬行管里，直至沿新的電場軸向重新定向后，才能繼續向前移動。DNA分子越大，這種重排所需要的時間就越長。若DNA分子變換方向的時間小于電脈沖周期時，DNA分子就可以按其大小分開。29分子分型方法在流行病學調查中的應用細菌的分子分型方法30分子分型方法在流行病學調查中的應用細菌的分子分型方法

中國預防醫學科學院流行病學微生物學研究所31分子分型方法在流行病學調查中的應用32分子分型方法在流行病學調查中的應用細菌的分子分型方法盡管PFGE在許多病原體的分子流行病學研究中表現出很好的分辨能力，但是具體到應用它本身就存在著明顯的缺點，此種方法耗時、耗力而且對設備的要求也很嚴格。況且，當PFGE的圖形匹配得不是很好的時候，其結果依然難以解釋。況且，也不能夠僅僅以PFGE的結果為依據。33分子分型方法在流行病學調查中的應用細菌的分子分型方法在實際應用過程中，任何單一的方法所得出的結論都具有片面性，所以，聯合應用幾種方法是目前較為理想的分子分型方法。35分子分型方法在流行病學調查中的應用細菌的分子分型方法這其中又以PFGE與其它方法相結合的效果為最佳，先用分辨力較低的方法進行初篩，然后用分辨力較高的方法進行進一步的分型，這是目前大多數實驗室所采取的策略。隨著科學技術的發展和進步，會有更好的方法問世。36分子分型方法在流行病學調查中的應用細菌的分子分型方法我國部分地區分離到的E.coliO157:H7菌株的PFGE圖譜37分子分型方法在流行病學調查中的應用E.coliO157：H7的分子分型方法病人身上分離到的無毒株的E.coliO157：H7的PFGE圖譜38分子分型方法在流行病學調查中的應用E.coliO157：H7的分子分型方法病人身上分離到的有毒株的E.coliO157：H7的PFGE圖譜39分子分型方法在流行病學調查中的應用E.coliO157：H7的分子分型方法徐州地區E.coliO157:H7動物糞便分離株PFGE圖譜40分子分型方法在流行病學調查中的應用ICDC,ChinaCDC41分子分型方法在流行病學調查中的應用基因芯片的分子診斷研究基因芯片技術是90年代興起的一項前沿生物技術,它可以將生物學中許多不連續的分析過程,移植到固相的介質芯片上,并使其連續化和微型化。由于它橫跨生命信息、生物物理等眾多研究領域,涉及生命科學、化學、微電子技術、計算機科學、統計學和生物信息學等諸多自然學科,故已成為當今多學科交叉、綜合的前沿研究熱點。1雜交模型的建立現有病原體的分子生物學檢測方法通常需36~48小時Real-timePCR可在1h內得到結果，但有其局限性基因芯片可同時檢測多個病原體的許多參數選擇的探針具有敏感、重復性好的雜交信號2其它實驗條件的探索和優化42分子分型方法在流行病學調查中的應用

基因芯片的分子診斷研究

基本的技術路線點樣以及結果分析所用的儀器設備1點樣儀SDDC-2arrayer（VIRTEK）- 0,6nlperspot(spacing=0,5mm)- 108to1013oligonucleotides/μl(~105to1010oligos/spot)2掃描儀ScanArray4000XL（GSILumonics）43分子分型方法在流行病學調查中的應用基因芯片的分子診斷研究探針和引物的設計與合成

引物在目的基因片段上的位置

44分子分型方法在流行病學調查中的應用基因芯片的診斷開發工作探針的合成、修飾及固定20mers探針，5’-端氨基修飾靶DNA的擴增與熒光標記

dUTP-Cy3PCR產物的純化與測定45分子分型方法在流行病學調查中的應用基因芯片的分子診斷研究雜交及檢測20μl雜交混合液：6XSSPE，1%SBA，0.01%PVP，0.01%SDS，25%Formamide13mmHybri-wellchamber芯片的清洗和干燥熒光掃描以及結果分析（ScanArray4000XL，QuantArraysoftware）46分子分型方法在流行病學調查中的應用基因芯片的分子診斷研究其它實驗條件的探索和優化

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簡易芯片的制作功能化的芯片比較昂貴（1~10$/片），Kumaretal(NucleicAcidsRes28:e71,2000)等人報告了一種方法，可以把普通顯微鏡用載玻片經3-mercaptopropyl-trimethoxysilane活化后，與5‘-末端巰基(-SH)修飾的寡核苷酸直接結合，將捕獲探針固定在載玻片上，此方法具有簡單、快速、背景干擾小等優點。

2化學發光法檢測的探索通常，基因芯片的結果是通過數字化的激光掃描儀對熒光信號進行讀取和分析的，如Cy3,Cy5,Alexa594等。但熒光掃描儀價格昂貴而且我們的實驗表明該技術在自動化方面有欠缺，為了適應臨床實驗室以及結合微流體（microfluidic）裝置的應用，需要開展更簡單的檢測方法。- WesternBlue