分子發光分析法§5-1概述一、分子發光分析法及其分類某些物質的分子吸收一定能量后，電子從基態躍遷到激發態，以光輻射的形式從激發態回到基態，這種現象稱為分子發光，在此基礎上建立起來的分析方法為分子發光分析法較高激發態基態吸收能量受激光輻射退激分子在退激過程中以光輻射形式釋放能量根據分子受激時所吸收能源及輻射光的機理不同分為以下幾類：光致發光：以光源來激發而發光

電致發光：以電能來激發而發光生物發光：以生物體釋放的能量激發而發光化學發光：以化學反應能激發而發光—化學發光分析法熒光—熒光分析法磷光—磷光分析法二、分子發光分析法的特點1.靈敏度高熒光強度隨激發光強度增強而增強（提高激發光強度，可提高熒光強度）

采用高靈敏度的檢測系統可大大提高靈敏度，檢測限熒光分析法比分光光度法低2~4個數量級激發發射熒光強強激發光物質2.選擇性好不同的物質用不同的光進行激發，選擇不同的激發光波長不同的物質發射的熒光不同，選擇不同的檢測熒光波長比較容易排除其它物質的干擾，選擇性好3.實驗方法簡單4.待測樣品用量少；儀器價格適中；測定范圍較廣具發光強度可定量測定許多痕量的無機物和有機物，廣泛應用在生物化學、分子生物學、免疫學及農牧產品分析、衛生檢疫等領域。應用還不夠廣泛，尚待拓寬。熒光法比磷光法應用廣泛，但均不如分光光度法廣泛。許多物質自身不會發射熒光（需衍生），且熒光分析對環境極為敏感：溫度、酸度、溶解氧、重金屬等均會產生影響或干擾。ii）量子效率足夠大：大多數含有酸性或堿性基團的芳香族化合物的熒光性質受溶液pH的影響很大化學反應必須產生足夠的化學能大多數有機分子的基態處于單重態；05時，If與f、I0、和c有關，對一給定物質，當激發光波長和強度一定時，f、I0、ε和b為常數，合并為K沒食子酸、洛粉堿、過氧草酸鹽等。應用還不夠廣泛，尚待拓寬。激發：excitated猝滅劑與熒光分子相互作用時發生了電子轉移引起的猝滅。指激發態分子與溶劑分子或溶質分子的相互作用而轉移能量，使熒光或磷光強度減弱或消滅（猝滅）3、可變波長同步掃描熒光法合適的可減少光譜重疊：在430~440nm藍光照射下，發出綠色熒光，em=535nm下測I，用標準曲線法測定利用魯米諾發光體系可以測定50余種元素和大量有機和無機化合物，靈敏度都比較高二、分子發光分析法的特點具有強熒光的分子多數有剛性平面結構，可以減少分子的振動，使分子與溶劑或其它溶質分子的相互作用減少，也減少了碰撞去活的可能性，熒光強度大。在刑偵學中的魯米諾反應（LuminolTest），主要是指Luminol跟雙氧水和OH-離子間的反應，血液中血紅素的鐵離子，是該反應的催化劑。由于基團的n電子（孤對電子）的電子云與苯環上的軌道平行，共享了共軛電子，擴大了共軛體系，使熒光波長長移，熒光強度增強350分析速度快，易實現自動化§5-2分子熒光和分子磷光

molecularfluorescenceandphosphorescence一、熒光和磷光光譜的產生（一）激發過程具有不飽和基團的基態分子光照后，價電子躍遷產生熒光和磷光

電子基態第一電子激發態轉動能極躍遷振動能級躍遷電子能級躍遷

在光致激發和去激發光的過程中，分子中的價電子（、n電子）處于不同的自旋狀態，通常用電子自旋狀態的多重性來描述1、光譜項的多重型：M＝2S+1（1）單重態M=2S+1＝1（自旋相反）S＝0分子能級=電子能級(Ee)+振動能級(Ev)+轉動能級(Er)。S0,S1,S2,S3分別代表基態,第一,二,三激發單重態（2）三重態M=2S+1＝3（自旋平行）S＝1T1、T2、T3分別表示第一、二、三激發三重態優點：設備簡單，造價低，體積小，靈敏度高等Ip＝KCA+B→C*+DC*+F→F*+EF*→F+h當物質受光照射時，基態分子吸收光能產生電子能級躍遷，由基態躍遷至更高的單重態，電子自旋方向沒有改變（相反），凈自旋=0，這種躍遷是符合光譜選律的允許躍遷，S0→S1（二）化學發光效率和發光強度三、化學發光反應的類型磷光儀器在熒光儀樣品池上增加磷光配件：低溫杜瓦瓶和斬光片。靈敏度為1ng·mL-1大多數有機分子的基態處于單重態；氣相化學發光反應主要用于某些氣體的監測，有專用的監測儀。分立取樣式和流動注射式化學發光儀例1：CO+O（原子氧）→CO2*CO2*→CO2+h（1）碰撞猝滅（動態猝滅）衡量物質發射熒光的能力——廣泛應用于大氣污染監測、可監測空氣中的O3；由于各種去活化過程的存在，無論開始電子被激發至什么高能級，它都經過無輻射去激消耗能量后到S1的最低振動能級，熒光輻射能通常要比激發能量低，熒光波長比激發光波長長。吸光吸光熒光磷光速率極大，10-14~10-12s完成。2、處于基態的分子吸收能量后發生躍遷：當物質受光照射時，基態分子吸收光能產生電子能級躍遷，由基態躍遷至更高的單重態，電子自旋方向沒有改變（相反），凈自旋=0，這種躍遷是符合光譜選律的允許躍遷，S0→S1

若分子中電子躍遷過程中伴隨著自旋方向的改變（平行），由基態單重態→激發三重態，凈自旋0。這種躍遷為禁阻躍遷，S0→T1

平行自旋比成對自旋穩定(洪特規則)，三重態能級比相應單重態能級低；大多數有機分子的基態處于單重態；S0S2S1T1（二）去活過程（去激過程)Deactivation）

電子處于激發態是不穩定狀態，返回基態時，通過輻射躍遷(發光)和無輻射躍遷等方式失去能量；傳遞途徑輻射躍遷熒光延遲熒光磷光內轉移外轉移系間跨越振動弛豫無輻射躍遷激發態停留時間短、返回速度快的途徑，發生的幾率大，發光強度相對大。1、無輻射去激不伴隨發光現象的過程叫無輻射去激，體系內的多余的能量以熱的形式釋放（1）內部轉換（IC，InternalConversion）當兩個電子能級非?？拷灾疗湔駝幽芗売兄丿B時，相同的多重態之間的轉換，S2

→S1、T2-T1（2）振動馳豫（VR，VibrationalRelaxation）同一電子能級中，從較高振動能級到較低振動能級的過程。速率極大，10-14~10-12s完成。無論分子被激發到哪個激發單重態，均通過內轉換和振動弛豫，躍回第一激發單重態的最低振動能級。（3）系間竄躍(ISC，IntersystemConversion)不同多重態,有重疊的轉動能級,通過自旋-軌道耦合改變電子自旋,不同的多重態之間的非輻射躍遷，禁阻躍遷.S1→T1

（4）外部轉移（ExternalConversion，EC）指激發態分子與溶劑分子或溶質分子的相互作用而轉移能量，使熒光或磷光強度減弱或消滅（猝滅）發生系間竄躍電子需轉向，S1～T1間進行，比內部轉換困難T1S0ISCVRVRIC吸光吸光S0S1S2VR：振動馳豫IC：內部轉換ISC：系間竄躍2.輻射去激—產生熒光和磷光光譜（1）熒光當電子從第一激發單重態S1的最低振動能級→基態S0各振動能級（多為S1→S0躍遷）所產生的輻射叫熒光熒光是相同多重態間的允許躍遷，產生速度快，10-9~10-6s，又叫快速熒光或瞬時熒光，外部光源停止照射，熒光馬上熄滅由于各種去活化過程的存在，無論開始電子被激發至什么高能級，它都經過無輻射去激消耗能量后到S1的最低振動能級，熒光輻射能通常要比激發能量低，熒光波長比激發光波長長。熒激>T1S0ISCVRVRIC吸光吸光熒光圖5-1分子熒光光譜產生過程示意圖S0S1S2VR：振動馳豫IC：內部轉換ISC：系間竄躍（2）磷光由第一激發三重態的最低振動能級→基態(T1→S0躍遷）產生a.

電子由S0→T1的可能過程：（禁阻躍遷）S0→激發→振動弛豫→內轉移S→系間跨越T→振動弛豫→T1b.

從T1

S1要改變電子自旋，發光速度慢，約為10-4~10s，光照停止后，磷光仍可持續一段時間c.

分子相互碰撞的無輻射能量塤耗大，所以磷光的波長更長

磷>熒>激

*易產生熒光

n*易產生磷光T1S0ISCVRVRIC吸光吸光熒光

磷光圖5-1分子熒光、磷光光譜產生過程示意圖S0S1S2VR：振動馳豫IC：內部轉換ISC：系間竄躍VR用機械切光裝置——磷光鏡區別熒光和磷光。例1：NO+O3→NO2*+O2NO2*→NO2+h使發射單色器與激發單色器之間保持一個恒定的波數差根據化學發光強度間接測定葡萄糖。一、熒光和磷光光譜的產生吸收光譜中能級越高波長越短，發射光譜中能級越高，波長越長。熒激ex/nmem/nm46365400一、熒光和磷光光譜的產生采用高靈敏度的檢測系統可大大提高靈敏度，檢測限熒光分析法比分光光度法低2~4個數量級利用熒光壽命短，磷光壽命長消除熒光干擾。固體表面室溫磷光分析法已成為多環芳烴和雜環化合物的快速、靈敏的分析手段。——又稱核黃素，是一種生長促進劑，常存在于動物肝臟、肉類、蛋黃、豆類、花生、蘑菇和海藻中。激發光譜曲線的最高處，處于激發態的分子最多，熒光強度最大第二單色器作用：發射單色器，濾掉一些雜散光和雜質所發射的干擾光，用來選擇測定用的熒光波長em。（1）內部轉換（IC，InternalConversion）一般來說，溶劑的極性增強，熒光波長長移，熒光強度增大合適的可減少光譜重疊：合適的可減少光譜重疊：脂肪族有機化合物的分子結構較為簡單，本身能發熒光的很少，一般需要與某些試劑反應后才能進行熒光分析S2S1S0T1吸收發射熒光發射磷光系間跨越內轉換振動弛豫能量l2l1l

3

外轉換l

2T2內轉換振動弛豫二、激發光譜和熒光、磷光光譜1、激發光譜熒光和磷光均為光致發光，合適的激發光波長需根據激發光譜確定Iex固定em熒光波長固定測量波長為熒光（或磷光）最大發射波長em

，然后改變激發波長，根據激發光波長ex對熒光（磷光）強度I作圖得激發光譜曲線。

激發：excitated發射：emission

激發光譜曲線的最高處，處于激發態的分子最多，熒光強度最大激發光譜形狀與吸收光譜形狀完全相似，經校正后二者完全相同！這是因為分子吸收光能的過程就是分子的激發過程。激發光譜曲線：I

～

ex吸收曲線：A

～

兩者在性質上是不同的Iex固定em熒光波長Iem固定ex激發光波長固定激發光波長(選最大激發波長),化合物發射的熒光(或磷光強度)與發射光波長關系曲線，以I為縱坐標，em為橫坐標得左圖，即熒光物質的發射光譜從曲線上找出最大的em2.發射光譜－熒光光譜(或磷光光譜)由于不同物質具有不同的特征發射峰，因而使用熒光發射光譜可用于鑒別熒光物質從圖中看出磷＞熒＞

激吸收峰熒光峰磷光峰3.激發光譜與發射光譜的關系a.Stokes位移激發光譜與發射光譜之間的波長差值。發射光譜的波長比激發光譜的長，振動弛豫消耗了能量。

b.發射光譜的形狀與激發波長無關

不管激發波長如何，分子受激后可到達不同能層的激發態，但通過去活化（內轉換和振動弛豫），電子都是從第一電子激發態的最低振動能層躍遷到基態的各個振動能層。

c.

鏡像規則通常熒光發射光譜與它的吸收光譜（與激發光譜形狀一樣）成鏡像對稱關系。具有強熒光的分子多數有剛性平面結構，可以減少分子的振動，使分子與溶劑或其它溶質分子的相互作用減少，也減少了碰撞去活的可能性，熒光強度大。試樣需在液氮溫度（77K）或液氦（4K）下測定－低溫磷光（將液池放在盛放液氮的杜瓦瓶內）在光致激發和去激發光的過程中，分子中的價電子（、n電子）處于不同的自旋狀態，通常用電子自旋狀態的多重性來描述多環芳烴是重要的環境污染物，可用熒光法測定∑Ki為非輻射躍遷的速率常數之和——主要取決于化學環境，也與化學結構有關激發光譜曲線的最高處，處于激發態的分子最多，熒光強度最大熒光量子效率f=氧分子及產生重原子效應的溴化物、碘化物等都是常見的熒光猝滅劑酚酞：無氧橋把兩個環固定，不能很好的共平面，為非熒光物質具有過氧化物中間產物的氧化還原反應可滿足要求。在刑偵學中的魯米諾反應（LuminolTest），主要是指Luminol跟雙氧水和OH-離子間的反應，血液中血紅素的鐵離子，是該反應的催化劑。05時，方括號中其它各項與第一項相比可忽略不計，上式簡化01~40g·mL-1不等這種躍遷為禁阻躍遷，S0→T1（二）熒光與分子結構的關系（內因）芳香族化合物因具有共軛的不飽和體系，多數能發生熒光激發：基態→第一激發態各振動能級，振動能級越（2）振動馳豫（VR，VibrationalRelaxation）Ip＝KC三維熒光光譜圖若分子中電子躍遷過程中伴隨著自旋方向的改變（平行），由基態單重態→激發三重態，凈自旋0。——又稱核黃素，是一種生長促進劑，常存在于動物肝臟、肉類、蛋黃、豆類、花生、蘑菇和海藻中。吸光吸光熒光根據分子受激時所吸收能源及輻射光的機理不同分為以下幾類：動化，分析效率低01~40g·mL-1不等沒食子酸、洛粉堿、過氧草酸鹽等。A*+羅丹明B→羅丹明B*+B（二）熒光與分子結構的關系（內因）01~40g·mL-1不等單重態激發態的分子在發生熒光之前和未激發的熒光物質碰撞，濃度較高時常發生。固定激發光波長(選最大激發波長),化合物發射的熒光(或磷光強度)與發射光波長關系曲線，以I為縱坐標，em為橫坐標得左圖，即熒光物質的發射光譜熒光分析比吸收光度法具有高得多的靈敏度，是因為熒光強度與激發光強度成正比，提高激發光強度可大大提高熒光強度在可見光區觀察化學發光，需170~300kJ·mol-1激發能。例：3，4–苯并芘在光致激發和去激發光的過程中，分子中的價電子（、n電子）處于不同的自旋狀態，通常用電子自旋狀態的多重性來描述無論分子被激發到哪個激發單重態，均通過內轉換和振動弛豫，躍回第一激發單重態的最低振動能級。根據化學發光強度間接測定葡萄糖。（三）金屬螯合物的熒光因此，發光反應可視為一級反應

c.

鏡像規則

基態上的各振動能級分布與第一激發態上的各振動能級分布類似。激發：基態→第一激發態各振動能級，振動能級越高，能級差越大，波長就越短。發射熒光：從第一激發態的最低振動能級→基態的各振動能級，基態的振動能級越高，其能量差越小，波長就越長。吸收光譜中能級越高波長越短，發射光譜中能級越高，波長越長。互為鏡像

基態上的零振動能級與第一激發態的振動能級之間的躍遷幾率最大，相反躍遷也然。

二、熒光、磷光與分子結構的關系（內因）產生并可觀察到熒光的條件：

i）分子具有與輻射頻率相應的熒光結構（內因）；

ii）量子效率足夠大：（一）熒光效率（熒光量子產率、量子效率）衡量物質發射熒光的能力

熒光量子效率f=發熒光的分子數激發態分子總數f

是一個物質熒光特性的重要參數，反映了熒光物質發射熒光的能力，f

越大，熒光越強，在0~1之間若以各種躍遷速率常數來表示Kf為熒光發射過程的速率常數——取決于物質的化學結構∑Ki為非輻射躍遷的速率常數之和——主要取決于化學環境，也與化學結構有關分析上有應用價值的熒光化合物的熒光效率在0.1~1之間合適的可減少光譜重疊：A*+羅丹明B→羅丹明B*+B具有過氧化物中間產物的氧化還原反應可滿足要求。A+B→C*+DC*+F→F*+EF*→F+h熒光分析比吸收光度法具有高得多的靈敏度，是因為熒光強度與激發光強度成正比，提高激發光強度可大大提高熒光強度同一電子能級中，從較高振動能級到較低振動能級的過程。所得的熒光強度I和波長曲線為同步熒光光譜。磷>熒>激如：甲基藍溶液的熒光被Fe2+離子猝滅同一電子能級中，從較高振動能級到較低振動能級的過程。熒光量子效率f=05時，If與f、I0、和c有關，對一給定物質，當激發光波長和強度一定時，f、I0、ε和b為常數，合并為K01~10000g·mL-1芳環上被F、Cl、Br、I取代后，使系間竄躍加強，磷光增強，熒光減弱。比較容易排除其它物質的干擾，選擇性好在氣相中O3能氧化NO、乙烯等產生化學發光，原子氧也能氧化NO、SO2、CO等產生化學發光。例：3，4–苯并芘二、分子發光分析法的特點3、可變波長同步掃描熒光法熒光猝滅法也是熒光分析中經常采用的方法。（二）熒光與分子結構的關系（內因）1、躍遷類型通常，具有*和n*躍遷結構的分子才能吸收紫外可見光，產生熒光

具有π—π*躍遷的量子效率比n—π*躍遷的要大得多（前者ε大、壽命短）總之，躍遷是產生熒光的主要躍遷類型。2、共軛效應具有共軛體系的芳環或雜環化合物，電子共軛程度越大，越易產生熒光;環越多，共軛程度越大，產生熒光波長越長（紅移），發射的熒光強度越強fex/nm

em/nm0.112052780.292863100.46365400苯萘蒽350菲線狀環結構比非線狀結構的熒光波長長

芳香族化合物因具有共軛的不飽和體系，多數能發生熒光多環芳烴是重要的環境污染物，可用熒光法測定

3，4-苯并芘是強致癌物ex=386nm

em=430nm3、剛性平面結構—較穩定的平面結構具有強熒光的分子多數有剛性平面結構，可以減少分子的振動，使分子與溶劑或其它溶質分子的相互作用減少，也減少了碰撞去活的可能性，熒光強度大。熒光素：氧橋把兩個環固定在一個平面上，具有平面結構，強熒光物質酚酞：無氧橋把兩個環固定，不能很好的共平面，為非熒光物質例1，2-二苯乙烯反式：平面構型強熒光體順式：非平面構型非熒光體4、取代基效應——取代基對熒光物質的熒光特征和強度也有很大影響。分成三類：（1）增強熒光的取代基

——

有-OH、-OR、-NH2、-NHR、-NR2等給電子基團由于基團的n電子（孤對電子）的電子云與苯環上的軌道平行，共享了共軛電子，擴大了共軛體系，使熒光波長長移，熒光強度增強（2）減弱熒光的取代基

——-COOH、-NO2

、-COOR、-NO、-SH吸電子基團,使熒光波長短移，熒光強度減弱芳環上被F、Cl、Br、I取代后，使系間竄躍加強，磷光增強，熒光減弱。其熒光強度隨鹵素原子量增加而減弱，磷光相應增強，這種效應為重原子效應。重原子效應溶液中若含有原子序數較高的重原子的分子或離子，如溴化物、碘化物等，導致容易發生系間跨越效應稱重原子效應。其原因是重原子的電子自旋和軌道運動間的相互作用變大，原子核附近產生磁場，使單重態向多重態系間跨越的幾率增加。含重原子的化合物熒光很弱，甚至無熒光，但磷光增強。（3）影響不明顯的取代基

——-NH3+、-R、-SO3H等（三）金屬螯合物的熒光大多數無機鹽類金屬離子，不能產生熒光，但某些螯合物都能產生很強的熒光，可用于痕量金屬離子的測定不少有機配體是弱熒光體或不發熒光，但與Mn+形成螯合物后變為平面構型，就會使熒光加強或產生熒光例：8-羥基喹啉為弱熒光體，與Mn+—Al3+、Mg2+形成螯合物后，能形成剛性結構，熒光加強使發射單色器與激發單色器之間保持一個恒定的波數差儀器設備簡單，成本低廉不同的物質用不同的光進行激發，選擇不同的激發光波長脂肪族有機化合物的分子結構較為簡單，本身能發熒光的很少，一般需要與某些試劑反應后才能進行熒光分析在光致激發和去激發光的過程中，分子中的價電子（、n電子）處于不同的自旋狀態，通常用電子自旋狀態的多重性來描述使兩單色器在掃描過程中以不同的速率同時進行掃描合適的可減少光譜重疊：因此，發光反應可視為一級反應利用表面活性劑在臨界濃度形成具多相性的膠束，改變磷光體的微環境、增加定向約束力，從而減小內轉換和碰撞等去活化的幾率，提高三重態的穩定性。二、熒光、磷光與分子結構的關系（內因）可測定結構復雜的大量有機物質，如：各種維生素、葉綠素、氨基酸、蛋白質、酶和輔酶以及各種藥物、毒物和農藥等魯米諾化學發光體系還可用于許多生化反應研究，常常涉及到H2O2的產生或H2O2參加反應，例如測定葡萄糖：食品加工過程也會產生3，4–苯并芘，尤其是煙熏、油炸、烘烤食品使發射單色器與激發單色器之間保持一個恒定的波數差同一熒光物質在不同的溶劑中可能表現出不同的熒光性質差越小，波長就越長。3、可變波長同步掃描熒光法熒光強度隨激發光強度增強而增強（提高激發光強度，可提高熒光強度）用機械切光裝置——磷光鏡區別熒光和磷光。要有有利的化學反應歷程。三、影響熒光強度的因素（外因）1.溶劑的影響同一熒光物質在不同的溶劑中可能表現出不同的熒光性質一般來說，溶劑的極性增強，熒光波長長移，熒光強度增大

2.溫度的影響——低溫下測定，提高靈敏度因為輻射躍遷的速率基本不隨溫度變，而非輻射躍遷隨溫度升高顯著增大。大多數熒光物質都隨溶液溫度升高熒光效率下降，熒光強度減弱。溫度對磷光影響更大3.pH的影響大多數含有酸性或堿性基團的芳香族化合物的熒光性質受溶液pH的影響很大共軛酸堿對是具有不同熒光性質的兩種型體，具有各自的熒光效率和熒光波長例：苯酚離子化后，熒光消失pH≈1有熒光pH≈13無熒光但兩個苯環相連的化合物，又表現出相反的性質，分子形式無熒光，離子化后顯熒光例：—苯酚有熒光無熒光另外，表面活性劑也會影響熒光強度和特性4.內濾光作用和自吸現象

自吸現象：內濾光中的一種，化合物的熒光發射光譜的短波長端與其吸收光譜的長波長端重疊，產生自吸收；如蒽化合物。

內濾光作用：溶液中含有能吸收激發光或熒光物質發射的熒光，如色氨酸中的重鉻酸鉀；5、溶解氧的影響溶液中的氧分子可使熒光溶液發射的熒光強度降低甚至熄滅。其原因較為復雜。溶解氧幾乎對所有的有機熒光物質均有不同程度的熄滅作用，對芳香烴尤為顯著。6、熒光猝滅——熒光物質與溶劑或其它物質之間發生化學反應，或發生碰撞后使熒光強度下降或熒光效率f下降稱為熒光猝滅。使熒光強度降低的物質稱為熒光猝滅劑氧分子及產生重原子效應的溴化物、碘化物等都是常見的熒光猝滅劑猝滅類型有：（1）碰撞猝滅（動態猝滅）處于單重態的熒光分子M*與猝滅劑分子Q碰撞，使M*以無輻射躍遷方式回到基態，產生猝滅。M非輻射躍遷M+熱碰撞猝滅（2）靜態猝滅（組成化合物的猝滅）部分熒光物質與猝滅劑生成非熒光的配合物。這一過程往往還會引起物質吸收光譜的改變。（3）轉入三重態的猝滅由于系間跨越躍遷，分子由單重態躍遷至三重態，轉入三重態的分子在室溫下不發光，易與其它分子碰撞而使熒光猝滅，若發射發射則為磷光。（4）發生電子轉移反應的猝滅猝滅劑與熒光分子相互作用時發生了電子轉移引起的猝滅。如：甲基藍溶液的熒光被Fe2+離子猝滅I-、Br-，S2O32-等易于給出電子的陰離子，使奎寧、羅丹明等熒光猝滅。（5）熒光自猝滅單重態激發態的分子在發生熒光之前和未激發的熒光物質碰撞，濃度較高時常發生。動化，分析效率低使兩單色器在掃描過程中以不同的速率同時進行掃描沒食子酸、洛粉堿、過氧草酸鹽等。例1：NO+O3→NO2*+O2NO2*→NO2+hn*易產生磷光吸收曲線：A～S0→激發→振動弛豫→內轉移S→系間跨越T→振動弛豫→T1利用魯米諾發光體系可以測定50余種元素和大量有機和無機化合物，靈敏度都比較高二、激發光譜和熒光、磷光光譜比較容易排除其它物質的干擾，選擇性好發光機理有待進一步研究根據激發和發射單色器在掃描過程中彼此間所保持的關系，同步掃描可分為固定波長差()和固定能量差及可變波長三種：05時，If與f、I0、和c有關，對一給定物質，當激發光波長和強度一定時，f、I0、ε和b為常數，合并為Kf是一個物質熒光特性的重要參數，反映了熒光物質發射熒光的能力，f越大，熒光越強，在0~1之間溫度的影響——低溫下測定，提高靈敏度優點：設備簡單，造價低，體積小，靈敏度高等食品加工過程也會產生3，4–苯并芘，尤其是煙熏、油炸、烘烤食品四、熒光強度與熒光物質濃度的關系用強度為I0的入射光，照射到液池內的熒光物質時，產生熒光，熒光強度If

用儀器測得，在熒光濃度很稀(A<0.05)時，熒光物質發射的熒光強度If與濃度有下面的關系If=fIa=f（I0-I）Ia為吸收的輻射強度I0為入射光強度熒光池I0IIf熒光強度檢測器If=f（I0-I010-A

）

=fI0

（1-10-A

）I=I010-A將上式展開當A﹤0.05時，方括號中其它各項與第一項相比可忽略不計，上式簡化

If=2.3fI0A=2.3fI0

εbc當A﹤0.05時，

If與f、I0、和c有關，對一給定物質，當激發光波長和強度一定時，f、I0、

ε和b為常數，合并為K

If=KC

定量分析依據熒光強度與物質濃度呈線性關系，If=KC只有在濃度低時使用，熒光物質測定的是微量或痕量組分，靈敏度高濃度高時，If與C不呈線形關系，有時C增大，If反而降低因為公式[]中后面影響，有時發生熒光猝滅效應If=

fI0

（1-10-A

）=fI0

（1-10-εbc

）（一）熒光分析儀器——主要由光源、單色器、液槽、檢測器和顯示器組成與分光光度計有兩點不同①兩個單色器②檢測器與激發光互成直角光源第一單色器激發單色器液池檢測器第二單色器發射單色器檢測器放大器及記錄器exemI0I五、熒光和磷光分析儀器與分光光度計有兩點不同具有不飽和基團的基態分子光照后，價電子躍遷產生熒光和磷光激發光譜形狀與吸收光譜形狀完全相似，經校正后二者完全相同！可測定結構復雜的大量有機物質，如：各種維生素、葉綠素、氨基酸、蛋白質、酶和輔酶以及各種藥物、毒物和農藥等應用還不夠廣泛，尚待拓寬。優點：設備簡單，造價低，體積小，靈敏度高等熒光和磷光均為光致發光，合適的激發光波長需根據激發光譜確定i）分子具有與輻射頻率相應的熒光結構（內因）；磷光儀器在熒光儀樣品池上增加磷光配件：低溫杜瓦瓶和斬光片。酚酞：無氧橋把兩個環固定，不能很好的共平面，為非熒光物質脂肪族有機化合物的分子結構較為簡單，本身能發熒光的很少，一般需要與某些試劑反應后才能進行熒光分析大多數熒光光度計一般采用兩個光柵單色器，有較高的分辨率，能掃描圖譜，既可獲得激發光譜，又可獲得熒光光譜（1）碰撞猝滅（動態猝滅）多環芳烴是重要的環境污染物，可用熒光法測定其原因是重原子的電子自旋和軌道運動間的相互作用變大，原子核附近產生磁場，使單重態向多重態系間跨越的幾率增加。優點：設備簡單，造價低，體積小，靈敏度高等第一單色器作用：激發單色器，分離出所需要的激發光，選擇最佳激發波長ex。>60nm時，只顯示色氨酸的特征光譜，實現分別測定。所得的熒光強度I和波長曲線為同步熒光光譜。一、熒光和磷光光譜的產生1、光源激發光源一般要求比吸收測量中的光源有更大的發射強度；適用波長范圍寬熒光光度計中常用高壓汞燈和氙弧燈利用汞蒸氣放電發光的光源；常用其發射365nm、405nm、436nm三條譜線以365nm的譜線最強應用最廣泛的一種光源，可發射250~800nm很強的連續光源激光誘導熒光LIF，laserinductivefluorescence——熒光物質與溶劑或其它物質之間發生化學反應，或發生碰撞后使熒光強度下降或熒光效率f下降稱為熒光猝滅。二、分子發光分析法的特點基態上的零振動能級與第一激發態的振動能級之間的躍遷幾率最大，相反躍遷也然。分立取樣式和流動注射式化學發光儀根據發光峰面積的積分值或峰高進行定量分析儀器設備簡單，成本低廉一、分子發光分析法及其分類激發：基態→第一激發態各振動能級，振動能級越氧分子及產生重原子效應的溴化物、碘化物等都是常見的熒光猝滅劑If=f（I0-I010-A）（二）熒光與分子結構的關系（內因）使發射單色器與激發單色器之間保持一個恒定的波數差熒激利用魯米諾發光體系可以測定50余種元素和大量有機和無機化合物，靈敏度都比較高化學發光是吸收化學反應所釋放化學能而使分子發光所建立的分析方法吸光吸光>60nm時，只顯示色氨酸的特征光譜，實現分別測定。具有強熒光的分子多數有剛性平面結構，可以減少分子的振動，使分子與溶劑或其它溶質分子的相互作用減少，也減少了碰撞去活的可能性，熒光強度大。=2.激發光譜曲線：I～ex二、熒光、磷光與分子結構的關系（內因）2、單色器大多數熒光光度計一般采用兩個光柵單色器，有較高的分辨率，能掃描圖譜，既可獲得激發光譜，又可獲得熒光光譜第一單色器作用：激發單色器，分離出所需要的激發光，選擇最佳激發波長

ex

。第二單色器作用：發射單色器，濾掉一些雜散光和雜質所發射的干擾光，用來選擇測定用的熒光波長

em。在選定的

em

下測定熒光強度，定量分析3、樣品池盛放測定溶液，通常是石英材料的方形池，四面都透光，只能用手拿棱或最上邊4、檢測器熒光的強度一般較弱，要求檢測器有較高的靈敏度，熒光光度計采用光電倍增管熒光分析比吸收光度法具有高得多的靈敏度，是因為熒光強度與激發光強度成正比，提高激發光強度可大大提高熒光強度5、讀出裝置記錄儀記錄或打印機打印出結果，掃描激發光譜和發射光譜同步熒光光譜1971年Lloyd首先提出用同步掃描技術來繪制光譜圖，即同時掃描激發單色器和發射單色器波長的條件下測繪光譜圖。所得的熒光強度I和波長曲線為同步熒光光譜。同步掃描技術

根據激發和發射單色器在掃描過程中彼此間所保持的關系，同步掃描可分為固定波長差()和固定能量差及可變波長三種：1、固定波長差同步掃描熒光法

＝ex-em＝常數2、固定能量差同步掃描熒光法使發射單色器與激發單色器之間保持一個恒定的波數差3、可變波長同步掃描熒光法使兩單色器在掃描過程中以不同的速率同時進行掃描

同步掃描技術可簡化光譜，譜帶變窄，減少光譜重疊，提高分辨率。

合適的可減少光譜重疊：酪氨酸和色氨酸的熒光激發光譜相似，發射光譜嚴重重疊，但<15nm的同步光譜只顯示酪氨酸特征光譜；>60nm時，只顯示色氨酸的特征光譜，實現分別測定。六、熒光光譜法與紫外-可見分光光度法比較（一）相同點（二）不同點磷光分析法phosphorescence與熒光相比，磷光的特點：1、磷光壽命比熒光長2、磷光輻射的波長比熒光長（一）磷光強度：

Ip＝KC（二）溫度對磷光強度的影響試樣需在液氮溫度（77K）或液氦（4K）下測定（三）磷光分析儀器與熒光分析儀器相似，主要差異如下：1.試樣室試樣需在液氮溫度（77K）或液氦（4K）下測定－低溫磷光（將液池放在盛放液氮的杜瓦瓶內）

固體表面室溫磷光分析需特制試樣室2.磷光鏡有些物質既可產生熒光，又能產生磷光。用機械切光裝置——磷光鏡區別熒光和磷光。利用熒光壽命短，磷光壽命長消除熒光干擾。磷光儀器在熒光儀樣品池上增加磷光配件：低溫杜瓦瓶和斬光片。如右圖所示。斬光片的作用是利用其分子受激所產生的熒光與磷光的壽命不同獲取磷光輻射（四）室溫磷光低溫熒光需低溫實驗裝置且受到溶劑選擇的限制，1974年后發展了室溫磷光（RTP）。1）固體基質室溫磷光在室溫下以固體基質（如纖維素等）吸附磷光體，增加分子剛性、減少三重態猝滅等非輻射躍遷，從而提高磷光量子效率。2）膠束增穩室溫磷光利用表面活性劑在臨界濃度形成具多相性的膠束，改變磷光體的微環境、增加定向約束力，從而減小內轉換和碰撞等去活化的幾率，提高三重態的穩定性。3）敏化溶液室溫磷光（二）熒光分析法的應用1.無機化合物的分析無機化合物中，能直接產生熒光并應用于測定的為數不多，但與有機化合物生成發熒光的有機配合物后，進行熒光分析的元素達70多種，其中較常采用熒光法測定的元素有：Be、Al、B、Ga、Se、Mg、Zn、Cd及某些稀土元素能夠同金屬離子形成熒光配合物的有機試劑絕大多數是芳香族化合物，形成五元環或六元環的螯合物，分子的剛性平面結構增大，變為強熒光體熒光猝滅法也是熒光分析中經常采用的方法?？刹捎脽晒忖绶ㄩg接測定的離子有：F-、S2-、Co2+、Ni2+、Cu2+等2.有機化合物的分析脂肪族有機化合物的分子結構較為簡單，本身能發熒光的很少，一般需要與某些試劑反應后才能進行熒光分析芳香族化合物因具有共軛的不飽和體系，多數能發熒光；可直接用熒光法測定。對于具有致癌活性的多環芳烴——熒光分析法是最主要的測定方法可測定結構復雜的大量有機物質，如：各種維生素、葉綠素、氨基酸、蛋白質、酶和輔酶以及各種藥物、毒物和農藥等3、基因研究及檢測遺傳物質DNA自身的熒光效率很低，一般檢測不到其熒光。常選用某些熒光分子作探針，通過探針分析熒光的變化研究DNA與小分子及藥物的作用機理，從而探討致病原因及篩選和設計新藥。典型的熒光探針分子：溴化乙錠（EB）、吖啶類染料。例：3，4–

苯并芘為強致癌物質煤炭、石油、天然氣等燃料不完全燃燒以及吸煙、焚燒垃圾都會產生3，4–

苯并芘，汽車尾氣也是主要來源食品加工過程也會產生3，4–

苯并芘，尤其是煙熏、油炸、烘烤食品例：VB2——又稱核黃素，是一種生長促進劑，常存在于動物肝臟、肉類、蛋黃、豆類、花生、蘑菇和海藻中。在低濃度情況下，I=KC，I與C呈線性關系，在pH6~7熒光最強在430~440nm藍光照射下，發出綠色熒光，em=535nm下測I，用標準曲線法測定缺VB2會得口角炎、舌炎、唇炎、脂溢性皮炎維生素B2（三）磷光分析法應用能產生磷光的物質數量很少，磷光分析不及熒光分析普遍，但磷光分析法已在藥物分析、臨床及環境分析領域得到一定的應用。低溫磷光分析已應用在萘、蒽、菲、芘、苯并芘等多環芳烴及含O、S、N的雜環化合物分析固體表面室溫磷光分析法已成為多環芳烴和雜環化合物的快速、靈敏的分析手段。農藥、生物堿、植物生長激素的分析煙堿、降煙堿、新煙堿等分析§5-3化學發光分析法

Chemiluminescence,CL一、概述化學發光是吸收化學反應所釋放化學能而使分子發光所建立的分析方法化學發光與熒光的主要區別：受激發時所需的能量來源不同，需要化學反應過程中所提供的化學能化學發光分析具有以下特點靈敏度高——例：用熒光素酶和三磷酸腺苷ATP的化學發光反應，可測定低至2×10-17mol·L-1ATP線性范圍寬——一般有5~6個數量級儀器設備簡單，成本低廉分析速度快，易實現自動化局限性：可供發光用的試劑有限發光機理有待進一步研究二、化學發光分析的基本原理（一）化學發光反應的基本條件發光反應必須滿足以下條件1.化學反應必須產生足夠的化學能化學發光基于化學反應提供足夠的能量

A+B→C*+D產物接受反應能被激發

C*→C+h在可見光區觀察化學發光，需170~300kJ·mol-1激發能。具有過氧化物中間產物的氧化還原反應可滿足要求?；瘜W反應多是在有O3、H2O2等參加的氧化還原反應中2.要有有利的化學反應歷程。3.處于激發態分子能夠以輻射躍遷的方式返回基態（二）化學發光效率和發光強度1、化學發光效率CL激發態分子的化學效率激發態分子的發光效率r取決于發光所依據的化學反應本身f與熒光效率的影響因素相同，既取決于發光體本身的結構和性質，也受環境的影響2、化學發光強度具有高效率的化學發光是生物體中，亦稱生物發光。如：螢火蟲發光反應的效率幾乎接近100%，非生物體的化學發光效率一般不超過1%。化學發光強度ICL（t）與反應速度、化學發光效率有如下關系對下列化學發光反應A+B→C*+D

C+hICL隨時間和反應物消耗的變化逐漸減小A+B→C*+DA為待測物質，C為發光物質，當反應物B的濃度遠遠過量于待測物濃度時，B的濃度可認為是常數。因此，發光反應可視為一級反應t時刻的發光強度與該時刻的分析物濃度成正比化學發光總強度與分析物濃度呈線性關系。常用發光總強度來定量分析發光總強度三、化學發光反應的類型1.液相化學發光——研究和應用的比較廣泛的有：魯米諾、光澤精、沒食子酸、洛粉堿、過氧草酸鹽等。魯米諾是最常用的發光試劑，它可以測定Cl2、HClO、ClO-、H2O2、O2和NO2，產生