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文檔簡介
機體免疫功能的檢測技術第1頁,課件共63頁,創作于2023年2月第一節 免疫細胞的分離與純化第二節 體液免疫功能的檢測第三節 細胞免疫功能的檢測第四節 細胞因子及其受體的檢測技術第八章機體免疫功能的檢測技術
第2頁,課件共63頁,創作于2023年2月第一節免疫細胞的分離與純化一、細胞密度差異分離法二、細胞粘附與吞噬能力差異分離法三、細胞滲透壓敏感差異分離法四、細胞表面標志分離法五、其他細胞的分離和收集第3頁,課件共63頁,創作于2023年2月
根據不同細胞存在的密度差異即比重不同而分類。人外周血細胞的密度為:紅細胞1.093,粒細胞1.092,單個核細胞1.075~1.090,血小板1.030~1.035。
1.自然沉降分離法
2.密度梯度離心法一、細胞密度差異分離法第4頁,課件共63頁,創作于2023年2月上層:淡黃色血漿底層:紅細胞灰白層:白細胞1.自然沉降分離法第5頁,課件共63頁,創作于2023年2月(1)Ficoll密度梯度離心法(2)Percoll密度梯度離心法2.密度梯度離心法第6頁,課件共63頁,創作于2023年2月(1)Ficoll密度梯度離心法
即聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度離心法(ficoll-hypaquedensitygradientcentrifugation)Ficoll分層液的密度為:1.077±0.001
用于從外周血中分離單個核細胞第7頁,課件共63頁,創作于2023年2月用Ficoll分離外周血單個核細胞95%2000rpm20min血漿單個核細胞淋巴細胞分離液紅細胞粒細胞第8頁,課件共63頁,創作于2023年2月第9頁,課件共63頁,創作于2023年2月(2)Percoll密度梯度離心法
Percoll即聚乙烯吡咯烷酮包被的硅膠混懸液的商品名,為一種無細胞毒無刺激的新型連續密度梯度分層液。
Percoll原液密度1.135
用于從單個核細胞中分離單核細胞、淋巴細胞第10頁,課件共63頁,創作于2023年2月用Percoll分離單核細胞和淋巴細胞75%98%第11頁,課件共63頁,創作于2023年2月第一節免疫細胞的分離與純化一、細胞密度差異分離法二、細胞粘附與吞噬能力差異分離法三、細胞滲透壓敏感差異分離法四、細胞表面標志分離法五、其他細胞的分離和收集第12頁,課件共63頁,創作于2023年2月
單核/巨噬細胞具有較強的粘附能力,在37℃和Ca2+存在條件下,能主動粘附在玻璃、塑料、尼龍毛、棉花纖維或葡聚糖凝膠的表面,據此可建立許多從單個核細胞懸液中去除單核/巨噬細胞的方法,藉以獲得高純度的淋巴細胞。
1.細胞粘附力差異分離法
2.細胞吞噬能力差異分離法二、細胞粘附與吞噬能力差異分離法第13頁,課件共63頁,創作于2023年2月
單核/巨噬細胞具有較強的粘附能力,在37℃和Ca2+存在條件下,能主動粘附在玻璃、塑料、尼龍毛、棉花纖維或葡聚糖凝膠的表面,據此可從單個核細胞懸液中去除單核/巨噬細胞,獲得高純度的淋巴細胞。
B細胞也有一定的粘附能力,能粘附于尼龍纖維表面,可以將T細胞與B細胞分開。1.細胞粘附力差異分離法第14頁,課件共63頁,創作于2023年2月(1)粘附貼壁法:單個核細胞放在玻璃或塑料平皿中于37℃溫箱靜置1h,收集游離的淋巴細胞。(2)吸附柱過濾法:單個核細胞加入玻璃纖維或葡聚糖凝膠(Sephadex-G10),收集未吸附的淋巴細胞。
淋巴細胞放入尼龍纖維,可以吸附B細胞,游離細胞為T細胞。第15頁,課件共63頁,創作于2023年2月磁鐵吸引法:單核/巨噬細胞具有吞噬特性,可加入直徑為3um的羰基鐵顆粒或乳膠顆粒,待單核/巨噬細胞充分吞噬顆粒后,再用磁場吸附或通過密度梯度離心,獲得較純的淋巴細胞。2.細胞吞噬能力差異分離法第16頁,課件共63頁,創作于2023年2月第一節免疫細胞的分離與純化一、細胞密度差異分離法二、細胞粘附與吞噬能力差異分離法三、細胞滲透壓敏感差異分離法四、細胞表面標志分離法五、其他細胞的分離和收集第17頁,課件共63頁,創作于2023年2月三、細胞滲透壓敏感差異分離法
紅細胞對低滲的敏感性要高于白細胞,故可用不損傷白細胞的溫和低滲液處理以除去紅細胞。
1.低滲裂解法:蒸餾水
2.氯化銨處理法:0.83%氯化銨第18頁,課件共63頁,創作于2023年2月第一節免疫細胞的分離與純化一、細胞密度差異分離法二、細胞粘附與吞噬能力差異分離法三、細胞滲透壓敏感差異分離法四、細胞表面標志分離法
五、其他細胞的分離和收集第19頁,課件共63頁,創作于2023年2月四、細胞表面標志分離法
1.E-玫瑰花環沉降法
2.親和分離法
3.補體介導的特異性細胞毒分離法
4.免疫磁珠分離法
5.流式細胞儀分離法第20頁,課件共63頁,創作于2023年2月1.E-玫瑰花環沉降法第21頁,課件共63頁,創作于2023年2月2.親和分離法第22頁,課件共63頁,創作于2023年2月3.補體介導的特異性細胞毒分離法
是在補體的作用下裂解與抗體結合的細胞,從而分離出不能與此抗體結合的細胞亞群。這是一種負選性分離法,簡稱細胞毒法。第23頁,課件共63頁,創作于2023年2月4.免疫磁珠分離法
在磁珠表面包被了特異性抗體的免疫磁珠(immunomagneticmicrobeads,IMB),可與目標細胞表面的抗原結合而與特定細胞粘附,在磁場中可以分離IMB結合細胞與IMB非結合細胞。本方法快速、特異、高效,分離效果可與FACS法媲美,對儀器的要求卻低得多。
第24頁,課件共63頁,創作于2023年2月5.流式細胞儀分離法第25頁,課件共63頁,創作于2023年2月第一節免疫細胞的分離與純化一、細胞密度差異分離法二、細胞粘附與吞噬能力差異分離法三、細胞滲透壓敏感差異分離法四、細胞表面標志分離法五、其他細胞的分離和收集第26頁,課件共63頁,創作于2023年2月五、其他細胞的分離和收集
1.吞噬細胞的分離和收集
2.NK細胞和LAK前體細胞的分離第27頁,課件共63頁,創作于2023年2月1.吞噬細胞的分離和收集(1)人:組織液(斑蝥敷貼法)(2)小動物:腹腔巨噬細胞第28頁,課件共63頁,創作于2023年2月2.NK細胞和LAK前體細胞的分離單核細胞去除法:粘附法B淋巴細胞去除法:尼侖棉纖維T淋巴細胞去除法:E-玫瑰花環沉降法第29頁,課件共63頁,創作于2023年2月第一節 免疫細胞的分離與純化第二節 體液免疫功能的檢測第三節 細胞免疫功能的檢測第四節 細胞因子及其受體的檢測技術第八章機體免疫功能的檢測技術
第30頁,課件共63頁,創作于2023年2月第二節體液免疫功能的檢測一、免疫球蛋白的定量檢測二、外周血B細胞數目的檢測三、外周血B細胞功能的檢測第31頁,課件共63頁,創作于2023年2月一、免疫球蛋白的定量檢測
1.單向免疫擴散試驗
2.免疫比濁法
3.ELISA第32頁,課件共63頁,創作于2023年2月單相免疫擴散試驗第33頁,課件共63頁,創作于2023年2月第34頁,課件共63頁,創作于2023年2月第35頁,課件共63頁,創作于2023年2月第二節體液免疫功能的檢測一、免疫球蛋白的定量檢測二、外周血B細胞數目的檢測三、外周血B細胞功能的檢測第36頁,課件共63頁,創作于2023年2月二、外周血B細胞數目的檢測1.免疫熒光技術
2.花環試驗
3.流式細胞術第37頁,課件共63頁,創作于2023年2月第38頁,課件共63頁,創作于2023年2月
B細胞EA、EAC花環試驗
第39頁,課件共63頁,創作于2023年2月第40頁,課件共63頁,創作于2023年2月第41頁,課件共63頁,創作于2023年2月第二節體液免疫功能的檢測一、免疫球蛋白的定量檢測二、外周血B細胞數目的檢測三、外周血B細胞功能的檢測第42頁,課件共63頁,創作于2023年2月三、外周血B細胞功能的檢測1.B細胞增殖試驗
2.溶血空斑試驗
3.ELISPOT第43頁,課件共63頁,創作于2023年2月1.B細胞增殖試驗非特異性刺激物(美洲商陸)特異性刺激物(抗原)3H-TdR摻入法MTT法形態學計數法第44頁,課件共63頁,創作于2023年2月溶血空斑試驗第45頁,課件共63頁,創作于2023年2月第46頁,課件共63頁,創作于2023年2月第一節 免疫細胞的分離與純化第二節 體液免疫功能的檢測第三節 細胞免疫功能的檢測
第四節 細胞因子及其受體的檢測技術第八章機體免疫功能的檢測技術
第47頁,課件共63頁,創作于2023年2月第三節細胞免疫功能的檢測一、T細胞亞群和數目的檢測二、T細胞功能的檢測三、其他免疫細胞功能的檢測第48頁,課件共63頁,創作于2023年2月一、T細胞亞群和數目的檢測1.免疫熒光技術
2.花環試驗
3.流式細胞術第49頁,課件共63頁,創作于2023年2月第三節細胞免疫功能的檢測一、T細胞亞群和數目的檢測二、T細胞功能的檢測三、其他免疫細胞功能的檢測第50頁,課件共63頁,創作于2023年2月二、T細胞功能的檢測1.體外功能實驗
2.體內功能實驗第51頁,課件共63頁,創作于2023年2月1.體外功能實驗(1)T細胞增殖試驗(2)細胞毒試驗(3)ELISPOT第52頁,課件共63頁,創作于2023年2月(1)T細胞增殖試驗非特異性刺激物(PHA、ConA、PWM)特異性刺激物(抗原)3H-TdR摻入法MTT法形態學計數法第53頁,課件共63頁,創作于2023年2月(2)細胞毒試驗第54頁,課件共63頁,創作于2023年2月(2)細胞毒試驗第55頁,課件共63頁,創作于2023年2月第56頁,課件共63頁,創作于2023年2月2.體內功能實驗第57頁,課件共63頁,創作于2023年2月第三節細胞免疫功能的檢測一、T細胞亞群和數目的檢測二、T細胞功能的檢測三、其他免疫細胞功能的檢測第58頁,課件共63頁,創作于2023年2月三、其他免疫細胞功能的檢測1.巨噬細胞功能的檢測
2.NK細胞和LAK細胞功能的檢測第59頁,課件共63頁,創作于2023年2月1.巨噬細胞功能的檢測第60頁,課件共63頁,創作于2
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