五制分子生物學(xué)第1頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)重組DNA技術(shù)三、重組DNA技術(shù)的基本原理及操作步驟（一）目的DNA的分離獲取---分（二）載體的選擇與構(gòu)建---選（三）目的DNA與載體連接---接（四）重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞---轉(zhuǎn)1、轉(zhuǎn)化2、轉(zhuǎn)染3、感染第2頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)重組DNA技術(shù)三、重組DNA技術(shù)的基本原理及操作步驟（四）重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞---轉(zhuǎn)1、轉(zhuǎn)化：將重組質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)菌或酵母細(xì)胞的過程。感受態(tài)細(xì)胞：容易接受外源DNA進(jìn)入的細(xì)菌。轉(zhuǎn)化方法：化學(xué)方法(氯化鈣法)物理方法(電穿孔法)第3頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)重組DNA技術(shù)三、重組DNA技術(shù)的基本原理及操作步驟（四）重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞---轉(zhuǎn)1、轉(zhuǎn)化：第4頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)重組DNA技術(shù)三、重組DNA技術(shù)的基本原理及操作步驟（四）重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞---轉(zhuǎn)2、轉(zhuǎn)染：將外源DNA直接導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程。（包括噬菌體導(dǎo)入細(xì)菌的過程）轉(zhuǎn)化方法：化學(xué)方法(磷酸鈣共沉淀法，脂質(zhì)體融合法)物理方法(顯微注射法，電穿孔法)第5頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)重組DNA技術(shù)三、重組DNA技術(shù)的基本原理及操作步驟（四）重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞---轉(zhuǎn)2、轉(zhuǎn)染：第6頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)重組DNA技術(shù)三、重組DNA技術(shù)的基本原理及操作步驟（一）目的DNA的分離獲取---分（二）載體的選擇與構(gòu)建---選（三）目的DNA與載體連接---接（四）重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞---轉(zhuǎn)3、感染將外源DNA通過包裝成病毒顆粒，然后導(dǎo)入到細(xì)胞的過程。第7頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)重組DNA技術(shù)三、重組DNA技術(shù)的基本原理及操作步驟（一）目的DNA的分離獲取---分（二）載體的選擇與構(gòu)建---選（三）目的DNA與載體連接---接（四）重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞---轉(zhuǎn)1、轉(zhuǎn)化2、轉(zhuǎn)染3、感染第8頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)重組DNA技術(shù)三、重組DNA技術(shù)的基本原理及操作步驟（一）目的DNA的分離獲取---分（二）載體的選擇與構(gòu)建---選（三）目的DNA與載體連接---接（四）重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞---轉(zhuǎn)（五）重組體的篩選與鑒定---篩第9頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)重組DNA技術(shù)三、重組DNA技術(shù)的基本原理及操作步驟（一）目的DNA的分離獲取---分（二）載體的選擇與構(gòu)建---選（三）目的DNA與載體連接---接（四）重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞---轉(zhuǎn)（五）重組體的篩選與鑒定---篩1、遺傳標(biāo)志篩選法2、序列特異性篩選法3、親和篩選法第10頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)重組DNA技術(shù)三、重組DNA技術(shù)的基本原理及操作步驟（五）重組體的篩選與鑒定---篩1、遺傳標(biāo)志篩選法（1）利用抗生素抗性標(biāo)志篩選：含有抗生素的培養(yǎng)基上不含有載體的細(xì)菌含有載體的細(xì)菌是否含有外源DNA第11頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)重組DNA技術(shù)三、重組DNA技術(shù)的基本原理及操作步驟（五）重組體的篩選與鑒定---篩1、遺傳標(biāo)志篩選法（1）利用抗生素抗性標(biāo)志篩選：（2）利用基因的插入失活特性篩選：載體上需要有兩個(gè)篩選標(biāo)志外源DNA插入其中一個(gè)篩選標(biāo)志使其失去篩選作用另一個(gè)篩選標(biāo)志仍發(fā)揮作用第12頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）利用基因的插入失活特性篩選：第13頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）利用基因的插入失活特性篩選：如何得到含有重組質(zhì)粒的細(xì)菌？第14頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)重組DNA技術(shù)三、重組DNA技術(shù)的基本原理及操作步驟（五）重組體的篩選與鑒定---篩1、遺傳標(biāo)志篩選法（1）利用抗生素抗性標(biāo)志篩選：（2）利用基因的插入失活特性篩選：（3）利用標(biāo)志補(bǔ)救篩選：載體上的標(biāo)志基因表達(dá)，補(bǔ)救宿主細(xì)胞的缺陷基因，使細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基上存活。第15頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月1、遺傳標(biāo)志篩選法（3）利用標(biāo)志補(bǔ)救篩選：第16頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)重組DNA技術(shù)三、重組DNA技術(shù)的基本原理及操作步驟（五）重組體的篩選與鑒定---篩1、遺傳標(biāo)志篩選法（1）利用抗生素抗性標(biāo)志篩選：（2）利用基因的插入失活特性篩選：（3）利用標(biāo)志補(bǔ)救篩選：藍(lán)白篩選第17頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月（3）利用標(biāo)志補(bǔ)救篩選：藍(lán)白篩選第18頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月（3）利用標(biāo)志補(bǔ)救篩選：藍(lán)白篩選第19頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月（3）利用標(biāo)志補(bǔ)救篩選：藍(lán)白篩選第20頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月（3）利用標(biāo)志補(bǔ)救篩選：藍(lán)白篩選第21頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月（3）利用標(biāo)志補(bǔ)救篩選：藍(lán)白篩選X-gal藍(lán)色產(chǎn)物-半乳糖苷酶第22頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)重組DNA技術(shù)三、重組DNA技術(shù)的基本原理及操作步驟（五）重組體的篩選與鑒定---篩1、遺傳標(biāo)志篩選法（1）利用抗生素抗性標(biāo)志篩選：（2）利用基因的插入失活特性篩選：（3）利用標(biāo)志補(bǔ)救篩選：（4）利用噬菌體的包裝特性篩選：第23頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月

coscos12bp12bp48500bpNonessentialportionforreplicationLong(left)armShort(right)arm三、重組DNA技術(shù)的基本原理及操作步驟（五）重組體的篩選與鑒定---篩1、遺傳標(biāo)志篩選法（4）利用噬菌體的包裝特性篩選：重組λDNA的長度為其野生型長度的75%～105%時(shí)，才能包裝形成有活性的噬菌體顆粒。第24頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)重組DNA技術(shù)三、重組DNA技術(shù)的基本原理及操作步驟（五）重組體的篩選與鑒定---篩1、遺傳標(biāo)志篩選法2、序列特異性篩選（1）RE酶切法（2）PCR法（3）核酸雜交法（4）DNA測序法第25頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月三、重組DNA技術(shù)的基本原理及操作步驟（五）重組體的篩選與鑒定---篩2、序列特異性篩選（1）RE酶切法：提取陽性克隆的重組DNA第26頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月

Linearvector(2700bp)insert(300bp)

M空質(zhì)粒重組質(zhì)粒NcoIHindIII2700bp300bp提取陽性克隆的重組DNARE消化電泳有無DNA片段的插入；插入片段的大小三、重組DNA技術(shù)的基本原理及操作步驟（五）重組體的篩選與鑒定---篩2、序列特異性篩選（1）RE酶切法：第27頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月三、重組DNA技術(shù)的基本原理及操作步驟（五）重組體的篩選與鑒定---篩2、序列特異性篩選（1）RE酶切法：提取陽性克隆的重組DNA第28頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月（五）重組體的篩選與鑒定---篩2、序列特異性篩選（1）RE酶切法：第29頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月（五）重組體的篩選與鑒定---篩2、序列特異性篩選（1）RE酶切法：（2）PCR法：直接鑒定目的DNA的存在a、提取陽性克隆重組DNAb、用特異引物進(jìn)行PCRc、電泳PCR產(chǎn)物d、判斷PCR產(chǎn)物是否與外源DNA一致NcoIHindIII2700bp300bp第30頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月（五）重組體的篩選與鑒定---篩2、序列特異性篩選（1）RE酶切法：酶切鑒定插入片段（2）PCR法：直接鑒定目的DNA的存在（3）核酸雜交法：原位雜交鑒定陽性克隆第31頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月（五）重組體的篩選與鑒定---篩2、序列特異性篩選（1）RE酶切法：酶切鑒定插入片段（2）PCR法：直接鑒定目的DNA的存在（3）核酸雜交法：原位雜交鑒定陽性克隆（4）DNA測序法：最準(zhǔn)確的鑒定方法第32頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月（五）重組體的篩選與鑒定---篩2、序列特異性篩選（1）RE酶切法：酶切鑒定插入片段（2）PCR法：直接鑒定目的DNA的存在（3）核酸雜交法：原位雜交鑒定陽性克隆（4）DNA測序法：最準(zhǔn)確的鑒定方法3、親和鑒定法：抗原-抗體反應(yīng)Ab第33頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)重組DNA技術(shù)三、重組DNA技術(shù)的基本原理及操作步驟（五）重組體的篩選與鑒定---篩1、遺傳標(biāo)志篩選法2、序列特異性篩選3、親和鑒定法第34頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)重組DNA技術(shù)三、重組DNA技術(shù)的基本原理及操作步驟（五）重組體的篩選與鑒定---篩1、遺傳標(biāo)志篩選法（1）利用抗生素抗性標(biāo)志篩選：（2）利用基因的插入失活特性篩選：（3）利用標(biāo)志補(bǔ)救篩選：（4）利用噬菌體的包裝特性篩選：2、序列特異性篩選3、親和鑒定法第35頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)重組DNA技術(shù)三、重組DNA技術(shù)的基本原理及操作步驟（五）重組體的篩選與鑒定---篩1、遺傳標(biāo)志篩選法2、序列特異性篩選（1）RE酶切法（2）PCR法（3）核酸雜交法（4）DNA測序法3、親和鑒定法第36頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)重組DNA技術(shù)一、重組DNA技術(shù)中常用的工具酶二、重組DNA技術(shù)中常用的載體三、重組DNA技術(shù)的基本原理及操作步驟（一）目的DNA的分離獲取（二）載體的選擇與構(gòu)建（三）目的DNA與載體連接（四）重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞（五）重組體的篩選與鑒定（六）克隆基因的表達(dá)第37頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)重組DNA技術(shù)一、重組DNA技術(shù)中常用的工具酶二、重組DNA技術(shù)中常用的載體三、重組DNA技術(shù)的基本原理及操作步驟（六）克隆基因的表達(dá)基因表達(dá)是指結(jié)構(gòu)基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及所有加工過程。蛋白表達(dá)系統(tǒng)是指由外源基因、載體、宿主和輔助成分組成的體系。第38頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)重組DNA技術(shù)一、重組DNA技術(shù)中常用的工具酶二、重組DNA技術(shù)中常用的載體三、重組DNA技術(shù)的基本原理及操作步驟（六）克隆基因的表達(dá)蛋白表達(dá)系統(tǒng)是指由外源基因、載體、宿主和輔助成分組成的體系。第39頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)重組DNA技術(shù)二、重組DNA技術(shù)中常用的載體（一）克隆載體（二）表達(dá)載體1、原核表達(dá)載體2、真核表達(dá)載體三、重組DNA技術(shù)的基本原理及操作步驟（六）克隆基因的表達(dá)1、