色素、生理特性、生殖特性、抗病蟲性等有關的標記。一、形態標記形態標記能夠顯示遺傳多態性的外部形態。如株高、葉形、育性等。廣義形態標記水稻已鑒定出300多個標記基因棉花中已鑒定出160多個突變基因。染色體結構(如缺失、易位、倒位、重復等)二、細胞學標記細胞遺傳學標記能夠顯示遺傳多態性的細胞學特征。染色體數量（如單體、缺體、三體、四體）缺一對5A染色體，發育成斯卑爾脫小麥的穗型。普通小麥21對染色體都有其缺體，活力較差和育性較低。5A染色體有抑制斯卑爾脫小麥穗型的基因發現突變型比正常的直果曼陀羅（2n=24=12Ⅱ）多一個染色體（12Ⅱ+l），即11Ⅱ+lⅢ。直果曼陀羅(Daturastramonium)中發現球形蒴果19101920染色體長度、隨體和著絲粒，反映染色體的缺失、易位、倒位、重復染色體結構C帶、N帶、G帶等，反映染色體上常染色質與異染色質的分布染色體核型染色體帶型

三、生化標記生化標記貯藏蛋白、同工酶等標記種子貯藏蛋白白蛋白球蛋白醇溶蛋白谷蛋白不同植物，4種蛋白含量不同，如水稻、小麥中含有高水平的谷蛋白，玉米中主要是醇溶蛋白豆科作物主要是球蛋白種子貯藏蛋白的電泳分析已廣泛用于作物品種鑒別和種子純度鑒定。聚丙烯酰胺凝膠電泳同工酶（isozyme）具有功能相同而結構和理化性質不同的一類酶等位酶（allozymes）同一基因座上的不同等位基因編碼的同工酶共顯性四、分子標記（molecularmarker）分子標記以DNA多態性為基礎的遺傳標記7、檢測手段簡單快捷；開發和使用成本低。（一）分子標記的特點1、遺傳多態性高；2、多數為共顯性，信息完整3、在基因組中大量存在且均勻分布4、選擇中性5、穩定性、重現性好6、信息量大，分析效率高簡稱RFLP標記（二）分子標記的類型及原理分子標記技術大體分為四大類1、以DNA-DNA雜交為基礎的DNA標記技術（insituhybridization）限制性片段長度多態性標記（Restrictionfragmentlengthpolymorphisms）可變數目串聯重復序列標記（Variablenumberoftandemrepeats）簡稱VNTR標記原位雜交簡稱ISH2、基于PCR的DNA標記1）單引物PCR標記2）雙引物選擇性擴增的PCR標記3）通過克隆、測序來構建特殊雙引物的PCR標記。

限制性酶切片段的選擇性擴增3、基于PCR與限制性內切酶技術相結合的DNA標記分為兩類PCR擴增片段的限制性酶切如AFLP如CAPsSinglenucleotidepolymorphism，4、基于單核苷多態性的DNA標記單核苷酸多態性簡稱SNP用限制性內切酶酶切不同個體的基因組DNA后，含有與探針序列同源的酶切片段在長度上的差異。（三）主要分子標記1、RFLP（RestrictionFragmentLengthpo1ymorpams）限制性片段長度多態性1980，Bostein堿基替換、插入、缺失或重復造成某種限制性內切酶（restrictionenzymes）酶切位點的增加或喪失以及內切酶酶切位點間DNA片段變化基因組DNA序列上的變化（1）RFLP標記的原理（1）RFLP標記的分析步驟單拷貝或寡拷貝RFLP分析探針探針來源cDNA克隆基因組克隆（RandomGenome）PCR克隆

（3）RFLP標記的特點優點①數目幾乎無限②共顯性③可以利用現有探針，具有種族特異性④RFLP標記遍及全基因組⑥重復性好缺點成本較高;需要許多克隆探針；一個探針只能產生一個多態位點；所需DNA量大(5～15μg)；易造成環境污染隨機排列的寡聚脫氧核苷酸單鏈引物（10個核苷酸）。通過PCR擴增染色體組DNA所獲得的長度不同的多態性DNA片段。2、RAPD（RandomAmplificationPolymorphismDNA）RAPD，隨機擴增多態性DNA1990,Williams特異性取決于引物與模板DNA結合的特異性。PCR，聚合酶鏈式反應（polymerasechainreaction）Mullis等(1985)PCR反應：變性、復性、延伸。RAPD與經典的PCR反應的區別①引物②反應條件③擴增產物AP-PCR（Arbitrarilyprimedpolymerasechainreaction)任意引物PCR引物長度與一般PCR反應中的引物相當開始階段退火溫度較低DAF（DNAamplificationfingerprinting）DNA擴增指紋引物長度比RAPD更短，為5～8個核苷酸DAF復性和延伸常用同一種溫度（2）RAPD標記的特點優點1）可檢測未知序列的基因組DNA2）引物無種族特異性3）RAPD技術簡單4）單個引物可產生幾個多態位點5）通過克隆測序可轉化成SCARSCAR（SequenceCharacterizedAmplificationRegion）特異序列擴增區域標記缺點1）再現性差2）顯性遺傳3）存在共遷移問題3、AFLP（AmplifiedFragmentLengthPolymorphisms）擴增片段長度多態性1993，Zabeaumarc和Vospieter是對限制性酶切片段的選擇性擴增（1）AFLP標記的原理基因組的DNA進行雙酶切人工接頭連接PCR反應的引物凝膠電泳AFLP擴增數量由酶切頻率較低的限制酶在基因組中的酶切位點數量決定。限制性酶酶切頻率較高的限制性酶（frequentcutter），酶切頻率較低的限制性酶（rarecutter）產生易于擴增基因組DNA限制擴增模板DNA片段的數量3）選擇擴增AFLP分析的基本步驟1）限制性核酸酶雙酶切基因組DNA2）DNA片段兩端連接上特定的接頭(oligonucleotideadapters)6）自顯影4）聚丙烯酰胺凝膠電泳5）凝膠轉移，干膠處理熒光標記、銀染（2）AFLP標記的特點優點

1）數目和種類很多

2）一次PCR反應可檢測多個遺傳位點3）AFLP分析模板用量少4）分辨率高5）假陽性低，可靠性高6）AFLP標記多數為顯性缺點分析成本高DNA的純度及內切酶質量要求也比較高甲基化敏感酶易產生假假陽性(Variablenumbertandemrepeat)4、SSR（SimpleSequenceRepeat）1987，Nakamura生物基因組內有一種短的重復次數不同的核心序列可變數目串聯重復序列簡稱VNTR小衛星（minisatellites）微衛星（microsatellites）簡單重復序列，又稱微衛星DNA一類由1—6個堿基組成的基序（motif）串聯重復而成的DNA序列如（CA）n、（AT）n、（CC）n、（GATA）nn代表重復次數，其大小在10～60之間DNA復制或修復過程中的分子滑動（slippagereplication）或不等交換所致。微衛星DNA兩端的序列是相對保守的單拷貝序列（1）SSR標記的原理根據微衛星DNA兩端的單拷貝序列設計一對特異引物，利用PCR技術，擴增每個位點的微衛星DNA序列，通過電泳分析核心序列的長度多態性。⑥凝膠電泳檢測建立SSR標記的一般程序①建立基因組DNA的質粒文庫②設計并合成探針，篩選重組克隆③陽性克隆DNA插入序列測序④根據SSR兩側序列設計并合成引物⑤PCR擴增2）檢測一個單一的多等位基因位點。（2）SSR標記的特點1）數量幾乎無限，檢測出多態性的頻率極高3）多數為共顯性標記使用SSR技術的前提是需要知道重復序列兩翼的DNA序列。4）重復性高，穩定可靠5）需DNA樣品量少，對DNA質量要求亦不苛刻引物設計采用2－4個核苷酸序列為基序（motifs），以其不同重復次數再加上幾個非重復的錨定堿基Inter-simplesequencerepeatpolymorphicDNAISSR標記相鄰SSR區域內的引物去擴增中間的單拷貝序列用小衛星做探針，與限制性內切酶酶切的基因組DNA雜交，檢測其多態性。小衛星（minisatellites）標記核心序列長度為10-60bp常用Southern雜交方法檢測共顯性遺傳5、SCAR（SequenceCharacterizedAmplificationRegion）特異序列擴增區域標記一般步驟RAPD分析克隆片段兩端測序設計長為18～24bp的引物PCR擴增檢測高的重復性優點6、CAPS（CleavedAmplificationPolymorphismSequence-taggedSite）切割擴增多態序列標簽位點技術又稱PCR-RFLP基本步驟特定引物PCR擴增PCR擴增產物限制性內切酶酶切酶切產物凝膠電泳檢測CAPs標記的優點①引物與限制酶組合非常多②

CAPS標記呈共顯性③所需DNA量極少④結果穩定可靠⑤操作簡便、快捷指基因組中長度為200—500bp，且核苷酸順序已知的單拷貝序列，可采用PCR技術將其專一擴增出來。7、STS（Sequence-taggedSites）序列標簽位點簡稱序標位YAC或cosmid插入末端序列引物來源RFLP單拷貝的探針序列微衛星序列表達基因序列很容易在不同組合的遺傳圖譜間進行標記的轉移，且是溝通植物遺傳圖譜和物理圖譜的中介。

8、ESTs（Expressedsequencetags）表達序列標簽直接與一個表達基因相關，很易于轉變成STS共顯性遺傳突出優點擴增基因開發閱讀框（openreadingframes,ORFs）。引物17-18個堿基，包括13-14個堿基的核心區域（5’的10-11個堿基為填充區，隨后正向為CCGG，反向為AATT），核心區域后為3個選擇堿基。9、SRAP（Sequence-relatedamplifiedpolymorphism）相關序列擴增多態性SRAP的特點優點1）每一反應可得大量多態位點2）不需克隆任何序列，引物可用于不同生物；3）便利、簡單；4）重復性好；5）PCR產物可直接測序。基因組中每隔1000個堿基就存在一單堿基差異。一般通過對PCR產物、基因組文庫、表達序列標簽（EST）文庫測序而獲得10、SNP（simplenucleotidepolymorphisms）單核苷酸多態性等位基因遺傳密碼的單堿基差異。特點：數量大第二節分子標記的應用一、遺傳多樣性分析AChromosomeMapofTomato二、遺傳圖譜的構建（一）作圖群體的建立1、親本的選配親本選擇的原則：1）親本間的DNA多態性豐富；2）親本純度高；3）雜交后代可育；2、群體的類型1）F2群體×F1P1P2F22）BC1群體3）RIL群體

RIL（recombinantinbredlines，重組近交系）群體是雜交后代經過多代自交而產生的一種作圖群體，通常從F2代開始，采用單粒的方法建立。常自交6-7代。4）DH群體高等植物的單倍體是含有配子染色體的個體。單倍體經過染色體加倍形成的二倍體稱為加倍單倍體或雙單倍體。5）NIL（near-isogenicline）群體一組遺傳背景相同或相近，只在個別區段存在差異的株系，稱為近等基因系（Near-isogeneiclinesNIL）。多代回交后自交一次即得回交自交品系。6）F1群體兩個雜合親本雜交產生的復合雜交群體（CP群體），擬測交（Pseudo-testcross）群體。3、群體的大小構建分子標記骨架連鎖圖可用小群體150單株或家系。1903年，Sutton&Boveri分別提出遺傳因子位于染色體上（二）圖譜構建的理論基礎1、染色體遺傳理論染色體理論的基本要點①體細胞的染色體成對存在②每條染色體能保持結構恒定性和遺傳連續性；③減數分裂同源染色體相互配對，隨后發生分離。連鎖圖譜構建的理論是染色體的交換和重組。AABB×abababABABabABba重組率可用來表示遺傳圖距，2、基因重組和連鎖理論重組型配子的最大比例為50%，變化0-50%。圖距單位用厘摩（centi-Mergan,cM）表示，1cM的大小大致符合1%的重組率。兩位點存在連鎖(r＜0.5)的概率與不連鎖的概率(r=0.5)比

為確定兩位點之間存在連鎖，一般要求似然比大于1000，即LOD＞3；而否定連鎖的存在，則要求似然比小于100，即LOD＜2。2、圖譜制作的統計學原理①兩點測驗L(r)/L(0.5)概率之比可用似然比統計量來表示似然函數L()②多點測驗一個位置上所發生的交換會減少其周圍另一個單交換的發生。圖距x與重組率間的關系當r=0.2時，x=21.2cM。3、交換干涉與作圖函數交換干涉干擾的程度可用符合函數C表示。作圖函數Kosambi作圖含數：（三）DNA標記分離數據的數學處理1、標記基因型數據的獲得利用分子對作圖群體的個體（株系）進行標記基因型檢測。P1P2F112345678910111213141516171819202122BHAAHHAHBAAHHHABHABAHH123456789101112??????2、分子標記連鎖圖的構建利用DNA標記數據，通過作圖軟件構建連鎖圖譜。

MAPMKER/EXE3.0

MapmangerQTX20

Joinmap（渝棉1號×T586）F2:7群體3、連鎖圖譜構建實例（四）DNA標記連鎖圖譜的完善1、DNA標記的染色體定位形態標記

非整倍體、染色體結構變異原位雜交

2、飽和DNA標記連鎖圖譜的制作遺傳圖譜的飽和度指單位長度染色體上已定位的標記數染色體連鎖框架圖的標記間的平均間隔在不大于20cM；主基因定位標記間的平均間隔在10-20cM；一般QTL定位標記間的平均間隔在10cM以下；基因克隆標記間的平均間隔在1cM以下。一種物種的DNA標記對另一物種進行遺傳和物理作圖三、比較作圖（comparativemapping）比較作圖比較作圖可揭示不同物種基因組或基因組區域同線性或共線性。比較作圖的分子基礎物種間DNA序列尤其編碼序列的保守性四、基因定位（一）質量性狀的基因定位1、近等基因系分析2、分離群體分組混合分析

控制數量性狀的基因（二）數量性狀的基因定位數量性狀的基因座（quantitativetraitloci,QTL）檢驗同一標記不同基因型間數量性狀均值的差異1、QTL定位的統計方法（1）基于標記的分析方法1）均值差檢測法若差異顯著，則表明標記與QTL連鎖。將個體的數量性狀表型值對單個標記或多個標記的基因型進行回歸分析2）性狀標記回歸法用被檢QTL兩側相鄰的連鎖標記來推測個體QTL的取值概率。3）性狀-QTL回歸法將個體的數量性狀表型值對假設存在的某個或某些QTL的基因型進行回歸分析。區間作圖法（intervalmapping）Lander&Bostein(1989)提出用被檢區間以外的部分或全部標記作為回歸模型中的余因子來消除其他QTL或遺傳背景的影響。4）性狀-QTL-標記回歸法復合區間作圖（compositeintervalmapping）多區間作圖（multipleintervalmapping）（2）基于性狀的分析方法1）分離群體分群分析法

1

11170

12135

131480

14215

15710

CMS育性恢復基因的分子標記2）選擇性基因型分析法2、QTL定位軟件

Mapmaker/QTL1.0

MapManagerQTX

QTLCartographer

WindowsCartographer

MapQTL3、QTL定位實例1）近等基因系QTLsassociate