第一節誘發突變的類型

誘發突變的分類可按后果或遺傳物質損傷的性質等多方面進行。較常見的分類是根據遺傳物質損傷能否用光學顯微鏡直接進行觀察。光學顯微鏡分辨率的極限為0．2um。這一長度的染色體約含4，7X106核苷酸對，在這一長度以下的改變不能用光學顯微鏡直接觀察，要依靠對其后代的生理、生化、結構等的表型改變來判斷突變的發生。遺傳物質損傷能用光學顯微鏡直接觀察的稱為染色體畸變(chromosomeaberration)，否則稱為基因突變(genemutation)，亦稱點突變(pointmutation)。

一、基因突變

基因突變即遺傳物質在分子水平上的改變，有堿基置換(basesubstitution)移碼(frameshift)和大段損傷。(一)堿基置換

堿基置換是某一堿基配對性能改變或脫落而引起的突變。此時首先在DNA復制時會使互補鏈的相應位點配上一個錯誤的堿基，即發生錯誤配對。這一錯誤配上的堿基在下一次DNA復制時卻能按正常規律配對，于是一對錯誤的堿基置換了原來的堿基對，亦即最終產生堿基對置換或簡稱堿基置換。原來的嘌呤被另一種嘌呤置換，或原來的嘧啶被另一種嘧啶置換，都稱為轉換；原來的的嘌呤被任一種嘧啶置換，或與此相反，原來的嘧啶被任一種嘌呤置換，都稱為顛換。無論是轉換還是顛換都只涉及一對堿基，是名符其實的點突變，其結果可造成一個三聯體密碼子的改變；此時可能出現同義密碼、錯義密碼或終止密碼。由于錯義密碼所編碼的氨基酸不同，于是基因表達產物的蛋白質有可能受到某種影響，終止密碼可使所編碼的蛋白質肽鏈縮短。

(二)移碼

移碼是DNA中增加或減少了一對或幾對不等于3的倍數的堿基對所造成的突變。由于堿基序列所形成的一系列三聯體密碼子相互間并無標點符號，于是從受損位點開始密碼子的閱讀框架完全改變，故稱移碼。其結果是：從原始損傷的密碼子開始一直到信息末端的氨基酸序列完全改變；也可能使讀碼框架改變其中某一點形成無義密碼(終止密碼），于是產生截短了的蛋白質產物，及一個無功能的肽鏈片段。移碼較易成為致死性突變。

UAG、UAA、UGA(三)大段損傷

大段損傷是DNA鏈大段缺失或插入。這種損傷有時可跨越兩個或數個基因，涉及數以千計的核苷酸。缺失的片段遠遠小于光學顯微鏡可觀察到的染色體缺失，故稱小缺失。它往往是DNA斷裂的結果，有時在減數分裂過程中發生錯誤聯合和不等交換也可造成小缺失。小缺失通常可引起突變。小缺失游離出來的DNA片段可整合到另一染色體某一位置而形成插入。每次整合都可能發生突變。小缺失的片段也可倒轉后仍插入原來位置而造成基因重排。

二、染色體畸變染色體畸變包括染色體結構異常和數目異常。

(一)染色體結構異常染色體結構異常是染色體或染色體單體受損而發生斷裂，且斷端不發生重接或雖重接卻不在原處。能使染色體或染色單體發生斷裂的物質稱為斷裂劑(clastogen)，這種作用的發生及其過程稱為斷裂作用。斷裂作用的關鍵是誘發DNA鏈斷裂。大多數化學斷裂劑像紫外線一樣，只能誘發DNA單鏈斷裂，故稱為擬紫外線斷裂劑。這種斷裂需要經過S期的復制，才能在中期相細胞出現染色單體型畸變（chromosome–typeaberration)

無論如何，擬紫外線斷裂劑的作用必須經過一個S期的作用之后才呈現出來。所以又稱為S期依賴斷裂劑（S-dependentclastogen）。DNA復制少數化學斷裂劑與電離輻射一樣，可誘發DNA雙鏈斷裂，故稱為擬放射性斷裂劑。所以如在S期已發生復制之后或G2期發生作用，在中期相呈現染色單體型畸變，而在G0期和G1期作用，則經S期復制，就會在中期相呈染色體型畸變。由于擬放射性斷裂劑能在細胞周期任一時期發生作用,并在立即到來的中期相觀察到染色體結構改變，故稱S期不依賴斷裂劑。在任何情況下見到的染色單體型畸變都將在下一次細胞分裂時衍生為染色體型畸變。

DNA復制由于擬放射性斷裂劑能在細胞周期任一時期發生作用,并在立即到來的中期相觀察到染色體結構改變，故稱S期不依賴斷裂劑。1.染色體畸變

是染色體中兩條染色單體同一位點受損后所產生的結構異常，可分為下列類型：(1)裂隙和斷裂(gapandbreake)：是指染色體上狹窄的非染色帶。過去以帶寬超過染色單體寬度為斷裂，不超過者為裂隙。此種線狀連接多排列成直線或圓滑弧形。無線狀連接者為斷裂(break)，保持線狀連接者為裂隙（gap)。一般認為裂隙屬于非染色質損傷。裂隙一向不計入畸變范圍。(2)無著絲粒斷片和缺失

(acentricfragmentanddeletion)：一個染色體發生一次或多次斷裂而不重接，并且這些已斷裂的節段遠遠分開，就會出現一個或多個無著絲粒斷片和一個缺失了部分染色質并帶有著絲粒的異常染色體，后者稱為帶著絲粒斷片。常將無著絲粒斷片簡稱為斷片(acentricfragment)，在下一次細胞分裂時斷片因無著絲粒，故不能進入分裂的核中而滯留在細胞質中，稱為微核(micronucleus,MN，1/5-1/20)。如斷片很小，小于染色單體寬度，則稱為微小體(minutebody)。缺失的類型——末端缺失與中間缺失例如：貓叫綜合征（46，5p-），慢性骨髓性白血病（46，22q-，也稱費城染色體，ph）。(3)環狀染色體(ringchromosome)：

染色體兩臂各發生一次斷裂，其帶有著絲粒的節段的兩斷端連接形成一個環時，稱為環狀染色體；如果是一條較長的無著絲粒斷片的兩端連接，就形成無著絲粒環。(4)倒位(inversion)：當某一染色體發生兩次斷裂后，其中間節段倒轉180再重接，稱為倒位。倒位的類型——臂內倒位與臂間倒位臂內倒位：不包括著絲粒區域的倒位。臂間倒位：包括著絲粒區域的倒位。(5)插入和重復(insertionandduplication)：當一個染色體發生三處斷裂，帶有兩斷端的斷片插入到另一臂的斷裂處或另一染色體的斷裂處重接起來，稱為插入。如此時有缺失的染色體和有插入的染色體是同源染色體，且分別有一處斷裂發生于同一位點，則插入將使該染色體連續出現兩段完全相同的節段，此時稱為重復。重復的類型染色體內重復——順向重復（銜接重復）、反向重復（倒位重復）

1234564567812345665478(6)易位(translocation)：從某個染色體斷下的節段接到另一染色體上稱為易位。單方易位：兩個染色體各發生一處斷裂，僅一個染色體的節段連接到另一個染色體上稱為單方易位，又叫不對稱易位相互易位：兩個染色體各發生一處斷裂，其節段相互交換重接形成兩個結構重排的染色體稱為相互易位，又叫對稱易位。復雜易位：三個或三個以上染色體發生斷裂，其節段相互交換重接形成的具有結構重排的染色體稱為復雜易位。

易位的類型——平衡易位與不平衡易位相互易位：也稱平衡易位，是指兩條非同源染色體互相交換染色體片段的易位。較常見，也研究得較多。單方易位：不平衡易位：也稱移位（shift），是指一條染色體的片段轉移到另一非同源染色體上的易位。2.染色體單體畸變

指某一位點的損傷只涉及姐妹染色單體中的一條。(1)染色單體裂隙、斷裂和缺失：含義與染色體型畸變的裂隙、斷裂和缺失基本相同，不同的是染色體中一條染色單體的結構改變。染色單體斷片在下一次細胞分裂中也可滯留于細胞質而成為微核。(2)染色單體交換（chromatidexchange)

是兩條或多條染色單體斷裂后變位重接的結果。在同一染色體內的染色單體交換稱為內換，在不同染色體之間的染色單體交換稱為互換。

(3)姐妹染色單體交換(sisterchromatidexchange,SCE)：

當使用差示染色法時，可見到染色體的兩條姐妹染色單體染色一深一淺。如某一染色體在姐妹染色單體間發生同源節段的內換，就會使兩條姐妹染色單體都出現深淺相同的染色，但同源節段仍然是一深一淺。這種現象稱為SCE。1978年ISCN(人類細胞遺傳學命名國際體制)將SCE列入染色單體型畸變的范圍，但其發生機理目前傾向于與染色單體斷裂無關。原理：半保留復制

(二)染色體數目異常

各種生物都有其固定的染色體數目和核型。以動物正常體細胞染色體數目2n為標準，染色體數目異常可能表現為整倍性畸變和非整倍性畸變。整倍性畸變可能出現單倍體、三倍體或四倍體。超過二倍體的整倍性畸變也統稱為多倍體。非整倍性畸變系指比二倍體多或少一條或多條染色體。例如：缺體是指缺少一對同源染色體，單體或三體系指某一對同源染色體相應地少或多一個，四體則指其比同源染色體多一對染色體；于是在染色體數目上相應為2n-2、2n-1，2n+1和2n+2。

第二節化學誘變的分子機理一、直接以DNA為靶的誘變（一）堿基損傷1、堿基類似物取代

有些化學物的結構與堿基非常相似，稱堿基類似物。它們能在S期中可與天然堿基競爭，并取代其位置。例如5－溴脫氧尿嘧啶核苷（Brdu）能取代胸腺嘧啶，2－氨基嘌呤(2-AP）能取代鳥嘌呤。

2、烷化劑的影響

烷化劑是對DNA和蛋白質都有強烈烷化作用的物質。烷化劑的種類很多，最常見的有烷基硫酸酯、N－亞硝基化合物、氮芥和硫芥以及鹵代亞硝基脲等。各類烷化劑其分子上的烷基各不相同，因而烷化活性有別，在一般情況下甲基化＞乙基化＞高碳烷基化。目前認為最常受到烷化的是鳥嘌呤的N－7位，其次是O－6位。而腺嘌呤的N－1、N－3和N－7也易烷化。目前認為鳥嘌呤的N－7位發生烷化后可導致鳥嘌呤從DNA鏈上脫落，稱為脫嘌呤作用。致使在該位點上出現空缺，即堿基缺失，其結果是移碼突變。即使在復制時空缺位上隨機配上一個堿基，也會導致轉換型或顛換型堿基置換。3、致突變物改變或破壞堿基的化學結構

有些化學物可對堿基產生氧化作用，從而破壞或改變堿基的結構，有時還引起鏈斷裂。例如，亞硝酸根能使腺嘌呤和胞嘧啶發生氧化性脫氨，相應變為次黃嘌呤和尿嘧啶。羥胺能使胞嘧啶C－6位的氨基變成羥氨基。這些改變都會造成轉換型堿基置換。但是亞硝酸雖然也能使鳥嘌呤變為黃嘌呤，但是由于黃嘌呤的配對性能與鳥嘌呤一致，故并不發生堿基置換。61

還有些化學物質可在體內形成有機過氧化物或自由基，如甲醛、氨基甲酸乙酯和乙氧咖啡堿等，可間接使嘌呤的化學結構破壞，容易出現DNA鏈斷裂。

4、平面大分子嵌入DNA鏈`

有些大分子能以靜電吸附形式嵌入DNA單鏈的堿基之間或DNA雙螺旋結構的相鄰多核苷酸鏈之間，稱為嵌入劑，它們多數是多環的平面結構，特別是三環結構，其長度為6.8102nm，恰好是DNA單鏈相鄰堿基距離的兩倍。如果嵌入到新合成的互補鏈上，就會使之缺失一個堿基；如果嵌入到模板鏈的兩堿基之間，就會使互補鏈插入一個堿基。無論多或少一個堿基都造成移碼突變。

（二）DNA鏈損傷

1．二聚體的形成

當細胞或機體受到紫外線刺激，會使DNA發生化學變化，其主要產生環丁烷嘧啶二聚體。這些損傷可阻止DNA的復制，并引起細胞死亡。紫外線和許多化學物致突變性表明突變作用作為細胞過程的復雜性，不僅涉及已改變堿基的配對特異性，而且還涉及與復制和修復有關的細胞機制相互作用。輻射的致突變機制有：使連接A-T、C-G之間的氫鍵斷裂；DNA分子的一個或兩個鍵中的糖—磷酸基之間斷裂；

DNA同一條鏈上，相鄰的嘧啶形成二聚體；水的電離，可產生自由基，也可引起突變。此外，輻射可形成DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂，從而引起缺失、倒位、易位，甚至堿基破壞，情況比較復雜。2．DNA加合物形成DNAadducts

它是活性化學物與細胞大分子之間通過共價鍵形成的穩定復合物，通常很難用一般的化學或生物學方法使其解離。例如，烷化的DNA加合物，O6—甲基脫氧鳥苷，可引起堿基置換，N—乙酰基-N-a—乙酰氨基芴的C8—鳥嘌呤加合物引起移碼突變。此外，DNA加合物的形成可活化癌基因，影響調節基因和抑癌基因的表達。3．DNA-蛋白質交聯物(DNA-proteincrosslinks，DPC)形成它是致突變物對生物大分子物質的一種重要的遺傳損害，也是一種穩定的共價結合物。已知許多外來化合物如烷化劑、苯并(a)芘、砷化合物、醛類化合物如甲醛及一些重金屬如鎳、鉻等，均可引起DNA-蛋白質發生交聯，雖然不同的化學物引起DNA-蛋白質交聯物的交聯有所不同，但DPC一旦形成，必將對DNA構象與功能產生嚴重影響。其原因是核蛋白作為維持DNA構象的重要成分，并參與DNA復制與轉錄的調控，故核蛋白與DNA交聯形成DPC，DPC出現將造成突變。

二、不以DNA為靶的間接誘變化學物的間接誘變可能是通過對紡錘體作用或干擾與DNA合成和修復有關的酶系統。(一)紡錘體抑制一些化學物能作用于紡錘體，中心粒或其他核內細胞器，從而干擾有絲分裂過程。誘發這種作用的物質稱為有絲分裂毒物，又稱干擾劑。無論紡錘體是部份或完全受抑制，都稱為有絲分裂效應。完全抑制時細胞分裂完全抑制，細胞停滯于分裂中期。秋水仙堿是典型的引起細胞分裂完全抑制的物質，因此這種效應又稱秋水仙堿效應。有些干擾劑僅使細胞群體的有絲分裂數減少，被稱之為抗有絲分裂劑。干擾劑不直接作用于遺傳物質，故嚴格說來并非真正的致突變物，但它同樣可誘發突變，特別是誘發與遺傳性疾病有密切關系的非整倍體，故引起密切注意，并作為致突變物的一個特殊類型來看待。

(二)對酶促過程的作用

對DNA合成和復制有關的酶系統作用也可間接影響遺傳物質。例如，一些氨基酸類似物可使與DNA合成有關的酶系統遭受破壞從而誘發突變。再有，鈹和錳除可直接與DNA相互作用外，還可與酶促防錯修復系統相作用而產生突變。

第三節突變后果一、體細胞突變的后果體細胞突變的后果中最受注意的是致癌問題，其次，胚胎體細胞突變可能導致畸胎，當然畸胎的發生還與親代生殖細胞突變有關。據報道人類妊娠最初3個月自然流產中有60%有染色體畸變，在一定程度上,這是致突變物透過胎盤作用于胚胎體細胞所致，而不完全是親代的生殖細胞突變的后果。

二、生殖細胞突變的后果

如果突變發生在生殖細胞，無論是在其發育周期的任何階段，都存在對下一代影響的可能性，其影響可分為致死性和非致死性兩類。致死性影響可能是顯性致死或隱性致死。顯性致死即突變配子與正常配子結合后，在著床前或著床后的早期胚胎死亡。隱性致死需要純合子或半合子才能出現死亡效應。如果生殖細胞突變為非致死性，則可能出現顯性或隱性遺傳性疾病，包括先天性畸形。在遺傳性疾病頻率與種類增多的同時，突變的基因，以及染色體損傷，將使基因庫（genepool)的遺傳負荷（geneticload)增加。基因庫是指一個物種的群體中在生殖細胞內具有并能傳給下一代的全部基因的總和。遺傳負荷是指一個物種的群體中每一個個體攜帶的可以遺傳給下一代的有害基因的平均水平。第五節化學致突變物的檢測致突變作用的檢測一般通過致突變試驗來檢測。目前已有方法200多種，但重要的有約20種。

一、觀察項目的選擇1．觀察效應終點的類型

基因突變和染色體畸變的檢測可直接反映化學毒物的致突變性，是評價化學毒物致突變性唯一可靠的方法。還有許多試驗所觀察到的現象并不反映基因突變、染色體畸變和染色體分離異常，而僅反映致突變過程中發生的其他事件。因此，將試驗觀察到的現象所反映的各種事件統稱為:遺傳學終點(geneticendpoint)。

國際環境致突變物致癌物防護委員會于1983年提出致突變試驗的遺傳學終點分為5類：①DNA完整性的改變(形成加合物、斷裂、交聯)；②DNA重排或交換；③DNA堿基序列改變；④染色體完整性改變；⑤染色體分離改變。其中③實際上指基因突變，④⑤指染色體畸變。下表是較常見的致突變試驗所反映的遺傳學終點。試驗DNA完整性改變DNA交換或重排DNA堿基序列改變染色體完整性改變染色體分離改變染色體分析1

微核12顯性致死12可遺傳易位12細菌回復突變1哺乳動物細胞正向突變1果蠅伴性隱性致死突變1小鼠特異座位實驗1酵母重組12SCE21細菌DNA修復12．成套的觀察項目

（1）概念由于一種致突變試驗通常只能反映一個或兩個遺傳學終點。實際工作中，沒有一種致突變試驗能涵蓋所有的遺傳學終點，故需用一組試驗配套進行檢測。用何種方法來評價化學毒物，主要取決于測試方案制定者的需要。例如，我國對食品、農藥化學品和工業毒物分別提出了相應的遺傳毒理學評價程序。從遺傳毒理學試驗中，包括基因突變、斷裂作用、重組作用、非整倍體或多倍體的測定試驗，受試化合物在任何一種試驗中出現可重復的陽性結果，即可認為是遺傳毒物。（2）遺傳毒理學評價程序

通常為一組體內、外遺傳毒理學試驗。因為：①化學毒物的種類和結構多種多樣，其致突變的機制不盡相同，作用的靶細胞也不一樣，有的是體細胞，或生殖細胞，或兩者兼而有之。故在成套觀察項目中既要用體細胞檢測又要用生殖細胞；除了從分子水平還要從細胞水平來檢測化學毒物的遺傳毒性。②致突變物中僅少數具有直接致突變作用，如烷化劑；大多數為間接致突變作用，即需要在體內代謝活化后，才具有致突變作用。體內試驗具有完整的活化系統，而體外試驗則通過加入模擬代謝系統，如S9來彌補缺乏活化系統的不足。這是體內與體外試驗的主要差別。在選擇體內、體外試驗時，還需要對其方方面面深入了解。③化學毒物的致突變性有強，也有弱；有的在某一檢測系統中是強致突變物，而在另一系統中可能是弱的致突變物。對于弱致突變物在某些系統中比較容易漏檢，即出現假陰性。所以，對每一化學毒物都需要一組試驗或成套試驗，來評價其遺傳毒性。（3）遺傳毒理學評價試驗選擇原則

關于遺傳毒理學成套觀察項目中哪些試驗可入選的原則有：①已知遺傳毒性主要有基因突變遺傳學終點。依照上表，選擇細胞回復突變試驗、微核試驗、細菌DNA修復試驗和SCE等四種致突變試驗，即可滿足要求。所以，選擇的遺傳毒性試驗原則上應包括5種類型的遺傳學終點。②通常的實驗材料有病毒、細菌、真菌、培養的哺乳細胞、植物、昆蟲及哺乳動物等。一般認為配套實驗應包括多種進化程度不同的物種，如原核細胞、低等和高等真核細胞，這樣觀察化學毒物在不同系統發育的多種生物體的致突變性，更具說服力。③體內試驗與體外試驗配合。體內試驗接近實際情況，但由于毒性動力學或其他原因，有時會漏檢致突變物。且在時間、經費、人力及物力均比體外試驗花費大。而體外試驗簡便易行，通常檢出率大大優于體內試驗。它的明顯不是在于生物轉化及解毒等方面與體內不同。故在配套試驗中，依據試驗目的，選擇體內和體外試驗，取長補短，綜合考慮。

目前，已確認的哺乳動物生殖細胞致突變物都在體細胞致突變試驗中得到陽性結果。一般認為，當體內體細胞致突變試驗得到陽性結果，并有生殖細胞接觸證據時，再進行哺乳動物生殖細胞致突變試驗。通常，對于一種受試物應當先用原核細胞或體細胞的體外試驗按遺傳學終點合理配套進行試驗，并對有陽性結果的遺傳學終點驗證其在體內的真實性，必要時再選用生殖細胞致突變試驗進行遺傳危害的評價。

二、致突變試驗(一)鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗

又稱Ames試驗，檢測受試物誘發鼠傷寒沙門氏菌組氨酸營養缺陷型突變株(his-)回復突變成野生型(his+)的能力。試驗菌株都有組氨酸突變(his-)，不能自行合成組氨酸，在不含組氨酸的最低營養平皿上不能生長，回復突變成野生型后能自行合成組氨酸，可在最低營養平皿上生長成可見菌落。計數最低營養平皿上的回變菌落數來判定受試物是否有致突變性。我國普遍采用的標準試驗菌株有四種：TA97和TA98檢測移碼突變、TA100檢測鹼基置換突變、TA102對醛、過氧化物及DNA交聯劑較敏感。這四個試驗菌株除了含有his-突變，還有一些附加突變，以提高敏感性。

1、TA系列測試菌株帶有的突變（1）深粗糙型突變(rfa)深糙粗型突變導致細菌表面的脂多糖屏障部份喪失，增加了對不能通過正常細胞壁的大分子的通透性。（2）切除修復基因uvrB缺失切除修復基因缺失使細菌對許多致突變物易感性顯著提高。（3）抗藥因子即R因子，是質粒的一種（PKM101質粒，使細胞具有抗氨芐青霉素的能力）。這里的作用：

PKM101質粒可以促使細胞通過易誤修復來處理DNA損傷，于是使化學誘變能力提高。（二）哺乳動物細胞基因突變試驗

通過對哺乳動物細胞體外培養的研究，已發現有幾十個基因座(locus)可出現各種突變類型的突變體(mutant)，常利用抗藥性的出現作為突變試驗的觀察終點。由于抗藥性是對正常基因座誘發的突變性狀，故稱為正向突變試驗(forward

mutationrest)。

最常用的基因座有三：

1、hprt基因座

HPRT(即次黃嘌呤鳥嘌呤轉磷酸核糖基酶)的編碼基因。hprt位于人和嚙齒動物的X染色體。由于X染色體在雌性有一條處于失活狀態，所以hprt基因座對于雄性是在結構上為單倍體狀態，而對于雌性則是在功能上處于單倍體狀態。

HPRT催化次黃嘌吟和鳥嘌呤與磷酸核糖焦磷酸反應，生成相應的核苷-5-單磷酸(NMP)。這是一條生成NMP的補充途徑。如果存在6-巰基嘌呤(MP)、6-硫代鳥嘌嶺(TG)、8-氮鳥嘌呤(AG)等堿基類似物，則以這些物質為底物可生成相應的NMP。NMP參入DNA中將導致細胞死亡。因此如受試物使hprt基因失活(hprt-)，細胞中的HPRT活性將大為下降，于是能在足以導致HPRT活性水平正常的細(hprt+細胞)死亡的嘌呤類似物存在下生長。即：抑制了生成NMP的補充途徑。合成NMP的補充途徑。一、從頭和成途徑利用磷酸核糖、氨基酸等簡單原料，經過一系列酶促反應，合成嘌呤核甘酸的途徑。合成部位主要在肝臟。從頭合成途徑的主要特點是在磷酸核糖分子上逐步合成的。二、合成NMP的補充途徑利用體內游離的嘌呤和嘌呤核苷，經過簡單的反應生成嘌呤核甘酸的過程。參與此途徑的酶：腺嘌呤核糖核酸轉移酶APRT次黃嘌呤鳥嘌呤轉磷酸核糖基酶HPRT腺苷激酶AdenosineKinase2、tk基因座

該基因座位于常染色體，其基因產物為胸苷激酶(TK)。該酶的底物是胸苷。野生型細胞(tk+)可酶促胸苷合成胸苷酸，并進一步生成DNA復制時必需的胸苷三磷酸。當存在堿基類似物(如Brdu和三氟胸苷等)時，由于產生異常的核苷酸而致細胞死亡。在受試物存在下，如細胞能對嘧啶類似物有抗性不致死亡，就說明該受試物誘發了tk基因座突變。3、ouar基因座

哺乳動物細胞的質膜上存在著Na+／K+

ATPase。當該酶的a-亞單位與烏本苷(ouabain，即毒毛旋花子甙G)結合，該酶即失活，從而導致死亡。與烏本苷感受性有關的基因存在于常染色體，如發生突變，即出現對烏本苷抗性，此時Na+／K+

ATPase的a-亞單位與烏本苷的結合力降低，從而導致細胞存活。

ouar突變體的表型是顯性的，較穩定。

以上幾個基因座最常用的是hprt，因其有關結構基因或調節基因發生堿基置換。移碼、小缺失，甚至X染色體重排，都可引起嘌吟類似物抗性。應用tk基因座的試驗也能檢出堿基置換和移碼等損傷。但是ouar僅能檢出堿基置換，因為當發生移碼或其他更嚴重的損傷時，基因轉錄提前終止，于是其正常產物將部分或全部消失。但是烏本苷抗性的表達需要該蛋白質的質量完整，因此堿基置換以外的嚴重損傷都將導致細胞死亡，而不是突變體細胞的出現。哺乳動物體外培養細胞的基因正向突變試驗常用的測試系統有小鼠淋巴瘤L5178Y細胞，中國倉鼠肺V79細胞和卵巢CHO細胞的三個基因位點的突變，即次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT)、胸苷激酶(TK)及Na+／K+ATP酶(OUA)位點。HGRPT和Na+/K+ATP酶位點突變可用于上述三種細胞，OUA位點突變僅適用于CHO細胞，HGRPT和TK可分別使6－硫代鳥嘌呤(6－TG)轉移上磷酸核糖及使5－溴脫氧尿苷磷酰化，它們的代謝產物可摻入DNA引起細胞死亡，因此正常細胞在含有這些鹼基類似物的培養基中不能生長，在致突變物作用下此兩個位點發生突變的細胞對這些鹼基類似物具有抗藥性，可以增殖成為克隆(細胞集落)。Na+/K+ATP酶是細胞膜上的Na+/K泵，烏本苷可抑制此酶活性引起細胞死亡，當致突變物引起該位點突變后Na+/K+ATP酶對烏本苷的親和力下降，而酶活性不變，故對培養基中的烏本苷產生抗藥性，并可增殖為克隆。

6#2011-10-13（三）微核試驗

微核(micronucleus)與染色體損傷有關，是染色體或染色單體的無著絲點斷片或紡錘絲受損傷而丟失的整個染色體，在細胞分裂后期遺留在細胞質中，末期之后，單獨形成一個或幾個規則的次核，包含在子細胞的胞質內，因比主核小，故稱微核。在細胞質中微核來源有二：斷片或無著絲粒染色體在細胞分裂后期不能定向移動，而遺留在細胞質中；有絲分裂毒物的作用使個別染色體或帶著絲粒的染色體環和斷片在細胞分裂后期被留在細胞質中。微核試驗(micronucleustest，MNT)是觀察受試物能否產生微核的試驗。其主要可檢出DNA斷裂劑和非整倍體誘變劑。微核試驗的靈敏度與細胞遺傳學試驗基本相同，但它觀察技術簡易而省時，故發展迅速。

觀察嗜多染紅細胞的微核。1、嗜多染紅細胞呈灰藍色，成熟紅細胞呈粉紅色。典型的微核多為單個的、圓形、邊緣光滑整齊，嗜色性與核質一致，呈紫紅色或藍紫色，直徑通常為紅細胞的1/20～1/5。2、每只動物計數1000個嗜多染紅細胞，觀察含有微核的嗜多染紅細胞數，微核率以千分率表示。3、觀察嗜多染紅細胞與成熟紅細胞（PCE/RBC），可作為細胞毒性指標之一。4、一般計數200個嗜多染紅細胞。受試物組未成熟紅細胞占紅細胞總數的比例不應少于對照組的20％.。1、PCE（polychromaticerythrocyte）嗜多染紅細胞，2、NCE（normochromaticerythrocyte）指正染紅細胞，3、RBC（redbloodcell）指紅細胞，包括PCE和NCE

PCE／NCE為評價細胞毒性的指標，代表未成熟紅細胞與成熟紅細胞的比值。微核試驗中計算PCE／NCE比值時，每只動物應至少計數200個紅細胞（即：PCE+NCE≥200個）。PCE／NCE與PCE／RBC（未成熟紅細胞占總紅細胞的比值）生物學意義相同，所以也常用PCE／RBC（％）表示。微核試驗中未成熟紅細胞占總紅細胞的比值不應少于對照組的20％。（討論：為什么？細胞分裂）

PCEPCE／NCEPCE／RBC目前對微核試驗已有較大的改進：①體外微核試驗常用細胞有中國倉鼠肺細胞(CHL)，中國倉鼠卵巢細胞(CHO)及中國倉鼠成纖維細胞(V79)等，體外試驗比體內試驗易于操作和控制受試物濃度。②周圍血微核試驗使其有可能成為在人群中觀察化學毒物遺傳毒性的一種手段。③雙核細胞法以提高微核的靈敏度。④免疫熒光染色法和熒光原位雜交法不僅可提高其靈敏度，還可判斷微核是來源于斷片還是染色體。(四)染色體畸變試驗1.染色體分析觀察染色體形態結構和數目改變稱為染色體分析。在國外常稱為細胞遺傳學檢驗，但這一名稱有時廣義地包括微核試驗和SCE試驗，因為這兩個試驗同樣也是在顯微鏡下觀察細胞染色體的改變。

對于結構畸變，一般只觀察到裂隙、斷裂、斷片、微小體、染色體環、粉碎、雙或多著絲粒染色體和射體。對于缺失，除染色單體缺失外，需作核型分析。即染色體攝影拍片后，再排列進行細微觀察或用電子計算機進行圖象分析。對于相互易位，除生殖細胞非同源性染色體相互易位外，倒位、插入、重復等均需顯帶染色才能發現。

對于數目畸變，需在染毒后經過一次有絲分裂才能發現。但是經過一次有絲分裂后，一些結構畸變可能因遺傳物質的丟失而致細胞死亡，因此不能發現。所以應安排多次收獲時間，以便分別檢查斷裂劑的作用。收獲時間的安排還應考慮外來化合物可能在細胞周期的不同時期產生作用，以及延長細胞周期的作用。

2.染色體畸變實驗方法

（1）原理

體細胞的染色體分析可作體內或體外試驗，體內試驗多觀察骨髓細胞，體外試驗常用中國倉鼠肺細胞(CHL)，以及中國倉鼠卵細胞(CHO)和V79等細胞系。染色體是細胞核中具有特殊結構和遺傳功能的小體，當化學物質作用于細胞周期G1期和S期時，誘發染色體型畸變，而作用于G2期時側誘發染色體單體型畸變。給試驗的大、小白鼠腹腔注入秋水仙素（處死動物前2～4h按4mg/kg體重腹腔注入秋水仙素），抑制細胞分裂時紡錘體的形成，以便增加中期分裂相細胞的比例，并使染色體絲縮短、分散，輪廓清晰。在顯微鏡下觀察染色體數目和形態。

（2）方法大鼠斷頭處死、小鼠頸椎脫臼。取股骨，去附著的肌肉，剪去兩端骨髓，用帶針頭的注射器吸取2～4mL2．2％檸檬酸鈉溶液，將骨髓洗入10mL離心管中，反復沖洗數次，然后以1000～1500r／min離心10min，棄去上清液。

低滲處理：

離心后的沉淀物加入4mL0．075mo1／L氯化鉀溶液，混勻后在37℃水浴或恒溫箱中放置10～20min，再以1000～1500r/min離心，棄去上清液。

固定：

將新配制甲醇、冰乙酸固定液4mL沿管壁加入樣品中，10～15min后，用吸管將細胞團塊打碎繼續固定10～15min，以1000r/mIn離心10min棄去上清液，再加固定液4mL靜置20min后離心，棄上清液，用吸管混勻制成0．5～1．0mL細胞懸液。

制片：

先將洗凈的載玻片保存于冰水中備用。載玻片，傾斜30°放置，立即吸取細胞懸液在玻片的1/3處滴3滴，輕吹細胞懸液：擴散平鋪于玻片上。每個樣品制2～3張玻片，空氣中自然干燥。

染片：

臨用時取Giemsa儲備液1mL加磷酸緩沖液10mL，置染色缸中，將涂片浸于染液中染色15min左右，取出玻片用水沖洗，空氣中自然干燥。觀察：每只動物分析100個中期相細胞，每個劑量組不少于1000個中期相細胞。觀察項目為染色體…數目和結構改變，統計學處理用x2檢驗。染色體數目的改變非整倍體：亞二倍體或超二倍體。多倍體：染色體成倍增加。內復制：包膜內的特殊形式的多倍化現象。染色體結構的改變斷裂：損傷長度大于染色體的寬度。微小體；較斷片小而呈圓形。有著絲點環：帶有著絲點部分，兩端形成環狀結構并伴有一雙無著絲點斷片。無著絲點環：成環狀結構。雙微小體：成對的染色質小體。裂隙：損傷的長度小于染色單體的寬度。非特定性型變化：如粉碎化、著絲點細長化、粘著等。環狀四價體鏈狀六價體和斷片(五)姐妹染色單體交換(SCE)試驗

SCE是染色體同源座位上DNA復制產物的相互交換，SCE可能與DNA的斷裂和重接有關，提示DNA損傷。SCE試驗可分為體外試驗、體內試驗和體內、體外結合試驗。體外SCE試驗可采用貼壁生長的細胞，如CHO、V79、CHL等，也可用懸浮生長的細胞，如人外周血淋巴細胞。姐妹染色單體交換試驗的原理：細胞在含5-溴脫氧尿苷(BrdU)的培養液中生長兩個周期。經過兩個分裂周期后，兩條染色單體，其中一條DNA鏈的雙股內的胸腺嘧啶核苷均被BrdU取代，另一條只有一股被取代。此時，用染色劑如吉姆薩和光處理，使雙股含BrdU的染色單體著色淺淡，而單股含BrdU的染色單體著色深。在普通光學顯微鏡下，可清晰分辨出交換的染色單體，計數SCE數。借此判斷受試物對DNA是否有損傷作用。對于分裂的細胞，如將5溴脫氧尿嘧啶核苷(5—BrdU)加入合成DNA的原料中，許多致突變物可誘導培養細胞和整體哺乳動物的SCE。盡管SCE測定方便、有效，但有關SCE的結果較染色體分析的結果可信度稍差些。主要是因為不能肯定SCE形成的機制，形成過程是否涉及DNA損傷或DNA合成的紊亂。

（六)程序外DNA合成試驗

基本方法是測定S期以外3H-胸苷摻入胞核的量，這一摻入量可反映DNA損傷后修復合成的量。由于此種合成發生在DNA正常復制合成主要時期以外，故稱為程序外DNA合成(unscheduleDNAsynthesis

UDS)試驗或DNA修復合成試驗。一般使用人淋巴細胞或嚙齒動物肝細胞等不處于正在增殖的細胞較為方便，否則就需要人為地將細胞阻斷于G1期，使增殖同步化。然后在藥物的抑制下使殘存的半保留DNA復制降低到最低限度，才能避免摻入水平很高的半保留復制對摻入水平很低的程序外DNA合成的觀察。

（七）果蠅伴性隱性致死試驗1、原理

果蠅伴性隱性致死試驗(sex-linkedrecessivelethaltest，SLRL)是利用隱性基因在伴性遺傳中具有交叉遺傳特征，即雄蠅的X染色體傳給F1代雌蠅，又通過F1代傳給F2代雄蠅。選擇黑腹果蠅(drosophilamelanogaster)為實驗動物，給予雄蠅受試物，如雄蠅的X染色體有突變，傳給F1代雌蠅，再通過F1代雌蠅傳給F2代雄蠅，使位于X染色體上的隱性基因在半合型雄蠅表現出來。2、方法

利用眼色性狀由x染色體上的基因決定，并與x染色體的遺傳相關聯的特征來作為觀察在x染色體上基因突變的標記，故以野生型雄蠅（紅色圓眼，正常蠅）染毒，與Basc（Muller-5）雌蠅交配，如雄蠅經受試物處理后，在x染色體上的基因發生隱性致死，則可通過上述兩點遺傳規則于F2代的雄蠅中表現出來，并籍眼色性狀為標記來判斷試驗的結果。即根據盂德爾分類反應產生四種不同表型的F2代，有隱性致死時在F2代中沒有紅色圓眼的雄蠅。注：Basc（Muller-5）雌蠅（淡杏色棒眼，在兩個x染色體上各帶一個倒位以防止F1代把染毒處理過的父系x染色體和母系X染色體互換）顯性致死即突變配子與正常配子結合后，在著床前或著床后的早期胚胎死亡。隱性致死需要純合子或半合子才能出現死亡效應。

果蠅的伴性遺傳SLRLtest的優缺點：sex-linkedrecessivelethaltest,SLRL是果蠅各種測試系統中最敏感的實驗，果蠅具有世代周期短、繁殖率高、飼養方便、經濟、判斷突變終點客觀、不需活化等優點，其不足之處是它與哺乳動物差異較大，所以對其結果外推應慎重。一般認為，果蠅實驗的陽性結果有高度的實用價值，而陰性結果在沒有真核系統試驗支持前不能完全認為無致突變性。SLRL能檢出點突變、小缺失、重排等幾種遺傳變異的類型。(八)顯性致死試驗1、原理

顯性致死即突變配子與正常配子結合后，在著床前或著床后的早期胚胎死亡。顯性致死突變指致突變物可引起哺乳動物生殖細胞染色體畸變，以致不能與異性生殖細胞結合或導致受精卵在著床前死亡，或導致胚胎早期死亡。本試驗是對雄性動物染毒，觀察一個精子發育周期中各個階段雌鼠胚胎早期死亡發生率的變化，進而判斷受試物有無對雄性生殖系統的損害及損害發生的敏感階段，是否具有致突變作用。它是評價化學毒物對雄性動物的生殖細胞遺傳較好的實驗方法之一。

2、檢測范圍顯性致死試驗(dominantlethaltest)是一種體內試驗，用于檢測整體哺乳動物生殖細胞遺傳性損傷，如單純的染色體斷裂所導致的大缺失或重復，或者同時還有因染色體重排所形成的不平衡染色體分離或不分離，即非整倍體。3、動物選擇動物多選用小鼠，也可用大鼠、倉鼠、豚鼠，設備簡單，較為實用。但靈敏度較差，使用動物量大。4、方法

（1）交配

于雄鼠給予受試物后，按雌雄鼠2：1比例同籠交配6d后，取出雌鼠另行飼養。雄鼠則于1d后，再以同樣數量的另一批雌鼠同籠交配，如此共進行5～6批。

（2）胚胎檢查以雌雄鼠同籠日算起第15～17d,采用頸椎脫日法處死雌鼠后，立即剖腹取出于宮，仔細檢查、計數，分別記錄每一雌鼠的活胎數、早期死亡胎數與晚期死亡胎數.

（3）胚胎鑒別

活胎：完整成形，色鮮紅，有自然運動，機械刺激后有運動反應。

早期死亡胚胎：胚胎形體較小，外形不完整，胎盤較小或不明顯。最早期死亡胚胎：僅在子宮內膜上隆起如一小瘤。如已完全被吸收，僅在子宮內膜上留一隆起暗褐色點狀物。

晚期死亡胚胎：成形，色澤暗淡，無自然運動，機械刺激后無運動反應。

5、統計分析

根據以上結果，計算出受孕率，總著床數，早期和晚期胚胎死亡率予以比較評價。孕鼠數（1）受孕率（％）=------------------（1）交配雌鼠數（2）總著床數=活胎數十早期胚胎死亡數十晚期胚胎死亡數（2）

總著床數（3）平均著床數=------------（3）受雌鼠數孕

（九)單細胞凝膠電泳試驗（SCGE)

1、原理

又稱彗星試驗(cometassay)，是一種近年發展起來的在單細胞水平上檢測有核細胞DNA損傷與修復的方法。增加的DNA遷移是和增加的SSB(單鏈DNA斷裂)的水平有關。可進行體外試驗和體內試驗。基本方法為：獲得細胞懸液，制作好含有細胞的瓊脂糖的載玻片；裂解細胞以釋放DNA；在堿性溶液中(pH13)獲得單鏈DNA，在堿性條件下電泳，中和堿，DNA染色和彗星顯像，記數彗星。

2、優點與其他遺傳毒性試驗相比，此方法的優點為：檢測低水平DNA損傷的敏感性高，對樣品的細胞數要求少，適應性高，低花費，操作簡便，使用的實驗物質相對少，完成實驗所需的時間較短。

（十）觀察方法的新進展

目前已知，對于致突變物有200種以上的測定方法。然而，大量的遺傳毒理學試驗主要依賴相對較少的幾個試驗，說明致突變試驗有許多地方需要完善。例如，隨著生活的現代化，人們不得不面對眾多的化學物質進入生活，就需要對這些化學物質的危害性作出評價，包括遺傳毒性的評價；對原有的方法提出新的要求，如自動化檢測。此外，隨著科學技術的進步，尤其是分子生物學技術的日新月異，有可能更準確地測定致突變作用，如轉基因小鼠致突變檢測系統和熒光原位雜交技術(FISH)。

(1)轉基因小鼠致突變檢測系統：

正常情況下，哺乳動物體內基因突變率很低，難以檢測。故檢測突變方法大多用于體外培養細胞。但由于體外試驗需加入模擬的代謝系統，其結果不盡如人意。隨著分子生物學技術發展，有可能在體內檢測基因突變，這就是轉基因小鼠致突變檢測系統。它是利用穿梭載體于原核和真核間往返轉移，帶可回收靶基因載體的轉基因小鼠提供哺乳動物體內基因的檢測系統，用以測定自發和誘發突變率，分析基因突變的組織專一性和順序變化，闡明DNA修復、基因毒性、突變和癌變的分子機制。轉基因動物是指基因組中整合以實驗方法導入的穩定的外源DNA，并能遺傳給后代的一類動物。

其優點有：可根據需要導入后代后仍能帶有目的基因，從根本上優于以前的體外檢測系統。已建有供致突變試驗用的轉基因小鼠模型，其注冊商品名為BigBlu