初級檢驗技師微生物檢驗第23章立克次體及檢驗立克次體及檢驗本章要點：概述致病性立克次體的檢測方法一、概述概念：立克次體是一類微小的原核細胞型微生物。立克次體的共同特征：大多是人畜共患病原體；以節肢動物為傳播媒介或儲存宿主；大小介于一般細菌與病毒之間，革蘭染色陰性，呈多形性；除極少數外均專性活細胞內寄生；對多種抗生素敏感。分類對人類致病的立克次體有五個屬：立克次體屬〔Rickettsia〕、柯克斯體屬、東方體屬、埃立克體屬和巴通體屬。外斐反響立克次體的耐熱多糖抗原與變形桿菌某些X株的菌體抗原〔OX19、OX2、OXK抗原〕具有共同的抗原性，因而臨床上常用后者代替相應的立克次體抗原進行非特異性凝集反響，這種交叉凝集試驗稱為外斐反響，用于立克次體病的輔助診斷。二、致病性〔一〕立克次體斑疹傷寒群主要包括普氏立克次體和莫氏立克次體。普氏立克次體常以人的體虱為傳播媒介，通過虱糞擦入損傷的皮膚，引起人與人之間傳播的流行性斑疹傷寒。莫氏立克次體莫氏立克次體的貯存宿主是鼠類，主要傳播媒介是鼠蚤或鼠虱，通過蚤糞擦入損傷的皮膚，引起地方性斑疹傷寒。恙蟲病立克次體通過恙瞞幼蟲叮咬傳給人，引起恙蟲病。貝納柯克斯體〔又稱Q熱立克次體〕以蜱為傳播媒介，也可不借助于媒介節肢動物而通過接觸、呼吸道、消化道等途徑傳給人，引起Q熱漢賽巴通體為桿菌性血管瘤-桿菌性紫癱和貓抓病的病原體，與貓抓傷、咬傷有關。三、立克次體的檢驗由于立克次體的傳染性較強，病原體的別離鑒定必須保證在平安防護的條件下進行，以防止實驗室感染的發生。〔一〕標本的采集和處理1.患者血液在病程第一周內并在使用廣譜抗生素前采集患者血液5～10ml，立即在患者床邊接種于動第 1頁共頁·1初級檢驗技師微生物檢驗第23章立克次體及檢驗物。血清學檢查標本一般采集3份血液標本，分別取自病程早期、病后1～1病后2～28。如患者已使用抗生4份標本。活檢或尸檢材料組織標本研磨制成10～20懸液，低速離心取上清接種，假設標本有細菌污染，可加青霉素〔1l000IU置室溫作用30m接種動物。〔二〕標本直接檢查立克次體的染色法多用于臟器標本的檢查。標本印片、固定后用熒光抗體染色或常規染色鏡檢。必要時作切片檢查。核酸檢測采用PCR手段。患者雙份血清的試驗結果，有利于立克次體病現癥診斷。間接免疫熒光〔I試驗、ELI間接法是目前檢測標本中特異性抗體的常用方法。間接微量免疫熒光技術的方法敏感，重復性好，又節省材料和時間，因而在血清學診斷及立克次體種別鑒定上廣泛應用。單份血清滴度≥：12者有現癥診斷意義，一般滴度在：1或以上即為陽性，倍增長可作IFAELI且操作繁瑣，除Q熱診斷外，此法已多被前兩者取代。2凝集試驗分為特異性凝集和非特異性凝集試驗兩種，具體方法如下：特異性凝集試驗：微量血凝試驗、間接血凝試驗、乳膠凝集試驗。微量血凝試驗以血清最高稀釋度呈凝集者為其滴度，達：以上者為陽性。間接凝集試驗滴度在：5以上有診斷價值。乳膠試驗結果與間接血凝結果相吻合。非特異性凝集試驗：外斐試驗常用于立克次體屬的三個生物型的診斷，缺乏敏感性和特異性。一般血清滴度達：1為陽性，病程中雙份或多份血清試驗，至少效價有倍增長才有診斷意義。四、斑疹傷寒立克次體〔一〕生物學特性第 2頁共頁·2初級檢驗技師微生物檢驗第23章立克次體及檢驗形態與結構斑疹傷寒立克次體比細菌小，呈多形性，有球形、球桿狀、長桿狀或長絲狀。在感染細胞內大多聚集成團分布在胞漿內。細胞壁不含磷壁酸，但含有胞壁酸、葡萄糖胺和二氨基庚二酸，與革蘭陰性菌的肽聚糖成分相似。斑疹傷寒立克次體最外表含有黏液層和微莢膜結構。2培養特性采用雞胚成纖維細胞、L929胞和Ve胞進行別離培養，繁殖一代2需要6時，培養時需要C。抗原構造立克次體有兩種特異性抗原，一種為群特異性抗原，與黏液層的脂多糖有關；另2一種為種特異性抗原，與細胞壁外膜的外表蛋白成分有關。大局部立克次體與普通變形桿菌某些菌株的耐熱多糖抗原有共同的抗原性，故可用這些菌株代替立克次體抗原進行非特異性凝集反響去檢測抗體，這種交叉凝集試驗稱為外斐反響〕，可作為立克次體病的〔Wiel-Felixreaction輔助診斷。4.因組本病原體MadridE體為1111523的環狀〕，可作為立克次體病的DN，G+含量為29.1mol%lmi株基因組全長為11114，為單鏈環狀DN，G+含量為28.9mol%力對熱敏感，耐低溫和枯燥，在干虱糞中能保持兩個月左右。對四環素和氯霉素類抗菌藥物敏感。磺胺可刺激其增殖。〔二〕致病性疹傷寒立克次體是地方性斑疹傷寒的病原體，嚙齒類動物是其主要儲存宿主，主要傳播媒介是鼠蚤或鼠，自然染周期為鼠蚤嚙齒類動物鼠虱、鼠蚤。本病原體主要致病物質有脂多糖、脂酶及微莢膜樣黏液層，患者以高熱、頭痛、全身損傷驗或尸檢材料作為檢測標本。標本直接檢査〕免疫熒光檢測：多用于臟器標本的檢査。熒光顯微鏡下可見脾、肺及心瓣膜贅。2〕核酸寒立克次體早期診斷、鑒別診斷以及自然生態宿主調查研究具有較大價值，且所需樣品量只需ELI實驗的1培養動物接種別離培養病原體，常用實驗動物為豚鼠，實驗動物應隔離飼養，以防交叉感染。每日觀察動物12，注意觀察其活動及飲食等有無異常情況。鑒定〕抗原檢測：用免疫熒光法鑒定感染動物臟器、雞胚卵黃囊、細胞培養物中的特異性抗原；并用抗原測定動物恢復期血清中的相應抗體。2〕抗體檢測：主要采用外斐反響、間接免疫熒光試驗、EL體結合。染色呈藍色；狀為常見。長約μm，平均μm；寬μm。革蘭染色陰性，吉姆薩染色呈紫紅色；MacchiavellGinez染色呈藍色；暗.k3抗原成分具有耐熱性多糖抗原和特異性抗原。與變形桿菌 O株具有共同抗原成分。.k.4基因組目前有BoryonIk在2007和202年被測序注釋。前者為線性 DN，全基因.組長212705，基因組G+含量為30.5mol%為環狀DN，全基因組長202198，基p組G+含量30mo〔二〕致病性恙蟲病的疫區主要分布在東亞、南亞、東南亞、太平洋島嶼、日本和我國的東南與西南地區。每年感染人數估計在一百萬人。病原體致病因素為死后所釋放的毒素樣物質，患者可表現為高熱，第 3頁共頁·3初級檢驗技師微生物檢驗第23章立克次體及檢驗通常在38~之間，寒戰、頭痛、肌肉痛。皮疹一般在發病后3-天出現。嚴重的患者常出現并發癥，包括肺炎、肝炎、心臟的病變、腎功能損害、腦膜炎和腦炎等。〔三〕微生物學檢驗患者采集血液標本、活檢或尸檢材料作為檢測標本。直接檢測〕抗原檢測：ELI間接法是檢測標本的特異性抗原或抗體的最常用方法。2〕PC：可以檢測出20ng蟲病立克次體DN水平。別離培養接種小鼠別離病原。抗體檢測主要采用外斐反響、間接免疫熒光試驗、EL體結合試驗等進行抗體檢測。六、貝納柯克斯體〔一〕生物學特性態與結構個體較小，多為短桿狀或球桿狀，常排列成對，大小為μ，寬μm，在細胞空泡中繁殖。Gn染色呈紅色，背景呈綠色，用Gie呈紫紅色。革蘭染色陰性，但著色不顯。有莢膜，約20n厚，呈絨毛狀。可有芽胞。2培養特點雞胚是培養大量立克次體的極好宿主。一般培養1029一個雞胚卵黃囊膜中的繁殖量可達2×1個立克次體。一般不引起明顯的細胞病變。抗原成分為顆粒性抗原，表現為兩相。94基因組目前共有株貝納柯克斯體被全基因組測序，均為環狀DN。抵抗力抵抗力強，70熱30-60min死，除了對乙醇、乙醚、三氯甲烷等脂溶劑敏感外，一般消毒劑殺滅該病原體較為困難。對氯霉素和四環素類抗菌藥物敏感。〔二〕致病性Q熱在我國絕大多數省、市和自治區均有報道。病原主要儲存于動物中，如牛、綿羊、山羊等，傳染源主要是受感染的牛、羊等。對人的感染力特別強，是立克次體中唯一可不借助于媒介節肢動物，而感染動物的排泄物污染環境后，通過接觸，氣溶膠經呼吸道、消化道等途徑感染人及動物。其致病物質為脂多糖。患者除出現發熱、頭痛及肌肉痛外，以出現肺炎和肝炎為其主要的臨床特征。〔三〕微生物學檢患者采集血液標本、活檢或尸檢材料作為檢測標本。直接檢測〕抗。2〕核酸別離只是在該地區尚未證明有Q熱存在，病情特別嚴重，致病源不能確定的流行中才有必要。一般實驗室多將標本接種于接免疫熒光試驗、EL體結合試驗等進行抗體檢測。七、埃立克體〔一〕生物學特性形態與結構革蘭陰性小球菌，呈多形性，直徑為μ。Romano藍色和紫色。電鏡下受侵細胞胞質內可見包涵體。基因組目前有株埃立克體屬菌株被全基因組測序。3抗原成分埃立克體有種主要蛋白抗原，其中22k為熱敏性，其他均為熱穩定性。各種埃立克體均可有血清學交叉反響，但交叉反響的程度有較大的差異。〔二〕致病性埃立克體屬有腺熱埃立克體、查菲埃立克體和人粒細胞埃立克體3個種，分別引起人腺熱埃立克體病、人單核細胞埃立克體病及人粒細胞埃立克體病。〔三〕微第 4頁共頁·4初級檢驗技師微生物檢驗第23章立克次體及檢驗染色，直接檢測〕直接顯微鏡檢査：標本經Giesaright在光鏡下觀察細胞內圓形、深紫色桑葚體進行檢測。2〕染色，核酸檢測：PC技術是最有效的埃立克體病的病原學診斷方法，可用于埃立克體病的早期診斷。別離培養可通過細胞培養、小鼠接種及從蜱內別離埃立克體來進行別離培養檢測。抗體檢測主要采用間接免疫熒光試驗、EL疫印跡試驗等進行抗體檢測。八、漢賽巴通體〔一〕生物學特性形態與結構為彎曲的桿狀小體，常呈多形性；革蘭染色陰性、Gie呈紫b藍色，鍍銀染色呈黃色。其大小為μ×μm初別離的漢賽巴通體有菌毛，初代后可消失。基因組大小為2005。培養特b性漢賽巴通體是營養要求苛刻的需氧桿菌，用新鮮綿羊、馬、兔或人血的瓊脂或巧克力、活性炭酵母浸液瓊脂以及心腦浸2液或心浸液瓊脂等。于35-3℃5%CO環境下培養。〔二〕致病性漢賽巴通體是巴通體屬內對人致病的一個重要病原微生物，2可引起人類桿菌性血管桿菌性紫癜和貓爪病。〔三〕微生物檢驗接檢測〕直接顯微鏡檢查：活檢病理標本用n-StarryWarthi染色能查見多形性病原體。2〕核酸檢測：PC技術是最有效的埃立克體病的病原學診斷方法。n-Starry患者血液和〔或〕研磨的組織懸液接種培養基，待長出菌落后做生化反響，分析其細胞脂肪酸和16Sr等加以鑒定。抗體檢測主要采用間接免疫熒光試驗、EL疫印跡試驗等進行抗體檢測。【習題】與立克次體有共同抗原成分的細菌是痢疾志賀菌大腸埃希菌綠膿桿菌變形桿菌產氣桿菌『正確答案』地方性斑疹傷寒的傳播媒介是蜱蚊鼠蚤恙螨鼠『正確答案』流行性斑疹傷寒的傳播媒介是蜱蚊鼠蚤第 5頁共頁·5初級檢驗技師微生物檢驗第23章立克次體及檢驗人虱恙螨『正確答案』D立克次體與細菌的主要區別是有細胞壁和核糖體含有DN和RN兩種核酸嚴格的細胞內寄生以二分裂方式繁殖