關于細胞培養的基本方法第1頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三第一節無菌操作技術第二節培養細胞的觀察第三節細胞培養中常用的染色方法第四節細胞培養的污染和檢測主要內容第2頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三教學目的和要求重點和難點：掌握細胞培養中無菌操作技術及操作過程中需要注意哪些問題；預防污染是無菌操作的關鍵。第3頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三

由于體外培養的細胞沒有抗感染能力，因此防污染是決定培養成功的首要條件。即便使用設備完善的實驗室，若實驗者粗心大意，技術操作不規范,也會導致污染。一切操作需要保證無菌和有條不紊。組織培養中最重要的，也是最基本的要求就是各項操作均應從無毒害、無污染的培養環境來考慮。培養基、器皿材料、接種工具、操作環境、培養室和超凈工作臺等各個環節都應注意。第一節無菌操作技術第4頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三一、實驗器具等的洗滌和材料的準備

在開始實驗前要制定好實驗計劃和操作程序。有關數據的計算要事先做好。根據實驗要求，準備各種所需器材和物品、清點無誤后將其放置操作場所(培養室、超凈臺)內，然后開始消毒。這可以避免開始實驗后，因物品不全往返拿取而增加污染機會。

第5頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三培養玻璃器具的洗滌是非常重要的。用完后應洗凈，再用蒸餾水沖一遍，烘干；用合適的方法滅菌。第6頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三二、培養室和超凈臺的消毒（一）、無菌與有菌范疇

滅菌工作是極其重要的。對于初學者來說，首先應建立有菌和無菌的概念。有菌的范疇：凡是暴露在空氣中的物體，至少其表面都是有菌的。如植物表面、超凈工作臺的臺面，未處理的工具、手等。第7頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三無菌的范疇：物理或化學處理的物體（工具、器皿、培養基等）健康的動植物不與外部表面接觸的組織內部可能是無菌的（有時也有內生菌，但不會影響培養，也不會污染）經過滅菌的物品有可能再次染菌第8頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三（二）無菌操作室

工作前后室內清掃、拖地，以防菌在空氣中流動，特別真菌孢子。使用前，室內及超凈工作臺紫外燈殺菌30分鐘，超凈工作臺酒精（75%）殺菌，工作中一直吹風。第9頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三三、洗手和著裝

原則上和外科手術相同。平時僅做觀察不做培養操作時，可穿著細胞培養室內紫外線照射30min的清潔工作服。在利用超凈臺工作時，因整個前臂要伸入箱內，應著長袖的清潔工作服，并于開始操作前要用75％酒精消毒手。如果實驗過程中手觸及可能污染的物品和出入培養室都要重新用消毒液洗手。進入培養室需徹底洗手還要戴口罩、著消毒衣帽。第10頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三第11頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三第12頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三第13頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三

無菌培養室每天都要用0.2%的新潔爾滅拖洗地面—次(拖布要專用)，紫外線照射消毒30-50min，超凈工作臺臺面每次實驗前要用75％酒精擦洗。然后紫外線消毒30min。在工作臺面消毒時切勿將培養細胞和培養用液同時照射紫外線，消毒時工作臺面上用品不要過多或重疊放置，否則會遮擋射線降低消毒效果。—些操作用具如移液器、廢液缸、污物盒、試管架等用75%酒精擦洗后置于臺內同時紫外線消毒。第14頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三四、無菌培養操作1、首先點燃酒精燈，所有操作均在火焰近處并經過燒灼進行；冷卻后才能使用；2、操作時，打開試管蓋，要進行燒灼滅菌，但是時間要短。在火焰上燒瓶口。保證容器傾斜。3、進行操作時動作要準確敏捷，但是不宜太快，防止空氣流動，增加污染的機會；第15頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三4、超凈工作臺上的器具和用品要擺放合理；5、操作時器具不能觸及瓶口以防止污染；6、不要說話、咳嗽、打噴嚏等，頭發、首飾等注意；7、吸管、注射器等專管專用。第16頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三

接種時在近火焰處打開瓶口，使瓶傾斜，以免空氣中微生物落入瓶中正

確

錯

誤

第17頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三整個接種操作應在近火焰處進行，且動作要迅速正

確

錯

誤

第18頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三防止操作帶來的污染

接種過程中盡可能達到懸空要求正

確

錯

誤

第19頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三正

確

錯

誤

接種時不得用手接觸瓶蓋內壁或瓶口第20頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三瓶蓋朝上放，接種完畢后立即蓋好瓶口正

確

錯

誤

第21頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三接種完一瓶用火燒用具以防止交叉污染產生

第22頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三種子和分生組織：培養時通常將其貼放在培養基表面，而不是插到培養基內部，以免供氧不足正

確

錯

誤

第23頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三接種莖段：注意形態學下端插入培養基內，而形態學上端露于空氣中

正

確

錯

誤

第24頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三

污染材料應及時清除，高壓滅菌。菌有兩種，細菌成粘液狀，真菌有菌絲。特別真菌危害極大。第25頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三五、使用超凈臺注意事項1、超凈臺安裝在清潔無塵的房間內，最好為隔離的無菌間，以免塵土過多易使濾器阻塞，降低凈化效果，縮短使用壽命；第26頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三第27頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三2、長期未使用或新安裝的超凈臺使用前必須對工作臺和周圍環境進行清掃，再采用化學滅菌或紫外線滅菌法進行滅菌處理；第28頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三3、使用前用75％酒精擦洗臺面，并提前用紫外線滅菌30min。關閉紫外燈后應啟動鼓風機運轉幾分鐘后再進行培養操作；第29頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三4、凈化工作區不應存放不必要的物品，以保持潔凈氣流型不受干擾；5、用后工作臺要用75％酒精擦洗，以備后面工作人員使用；6、經常注意工作區上方微壓表的指示，及時更換濾器。第30頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三六、培養細胞的取材取材組織用培養液浸泡，4度運送，24h內盡快培養。取材無菌操作，避免對組織的機械損傷，盡量去除脂肪、神經、結締、壞死組織，污染組織可用青鏈霉素和制霉菌素漂洗。原代取材同時保留組織學和電鏡標本，對供體來源、部位及一般情況做記錄。欲從組織中獲得大量生長良好的細胞，須將組織分散開，使細胞解離出來。常用方法有機械法和化學法。第31頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三第二節培養細胞的觀察第32頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三組織塊培養法將組織剪成小塊后，接種于培養瓶，24小時貼壁后，細胞就從組織周圍長出。培養瓶底預先涂以膠原薄層，以利上皮細胞的生長。如需做組織染色或電鏡檢查，可將組織可放入小蓋玻片上后再放進培養瓶培養。換液需輕巧，以免組織塊漂起，細胞死亡第33頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三消化培養法采用前述的組織消化分散法。將妨礙細胞生長的細胞間質去除，使細胞分散，形成懸液，按不同濃度接種培養瓶培養。第34頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三密度抑制（Densityinhibition）或接觸抑制（Ccontactinhibition）

1958年Abercrombie等學者提出的一種現象，培養細胞再生長過程中多發生分裂增殖，細胞移動而相互靠近，這時某些細胞可移向其他方向，保證細胞不會重疊，一但接觸，這種活動即可停止。

所謂接觸抑制實際使細胞匯合形成單層時，細胞變得擁擠，與培養液接觸的表面區域也相應減少，營養成分消耗，其分裂也將停止。第35頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三培養細胞的生長過程1）原代（初代）培養期：從機體取下組織培養到第一次傳代，此代細胞保持異質性，細胞種類較多，接近原組織細胞種類。維持時間，因細胞種類不同，一般1-4周。第36頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三2）傳代期培養：初代培養的細胞生長到一定程度，即可連接傳代，使其連續生長。一般正常二倍體細胞，不加附加條件，可傳代30-50代，此時可發生染色體丟失、突變、細胞增殖變慢、停止分裂，進入衰退期，我們稱之有限細胞系。這一轉折點有人稱之危象臨界點（crisis）有些細胞的少數后代，或通過人工條件轉化的細胞可通過這一期，獲得持久的增殖傳代能力，我們稱細胞系，或無限細胞系，即一般通稱的細胞系。第37頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三（3）衰退期：傳代細胞到達一定代數，即發生增殖緩慢，逐漸停止，進而發生衰退、死亡，多數傳代細胞（或叫有限細胞系），不能通過所謂的“crisis（危象臨界點），導致最終死亡，這一現象可能說明生物學衰老的細胞學基礎。

人胚胎成纖維細胞可以進行60代增殖，而80歲老人的肺成纖維細胞僅傳代了16代后便死亡。表皮細胞壽命4-10天；紅細胞3周-3個月，白細胞5-7天，神經細胞數年或更多。第38頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三第39頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三第40頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三第41頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三第42頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三第43頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三

實體顯微鏡（解剖鏡）倒置顯微鏡生物顯微鏡照相設備

對培養材料進行細胞學鑒定和研究2、顯微鏡觀察第44頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三第45頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三3、細胞計數法（cellcounting）用血細胞計數板計數細胞懸液中的細胞數目，以測定細胞增殖和調整細胞濃度的一種方法。第46頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三4、細胞生長曲線（cellgrowthcurve）是觀察細胞在一代生存期內的增生過程的重要指標。

橫坐標為培養時間

縱坐標為細胞密度注意：只有具備自身穩定生長特性的細胞才適合觀察。第47頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三細胞生長曲線細胞數量生長天數緩慢生長期對數生長期平衡期第48頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三

（1）遲緩期（或延遲期）當細胞接種到培養瓶后，細胞逐漸貼附于瓶底，并恢復貼壁形狀，代謝開始旺盛，出現細胞分裂及增殖，但生長緩慢。

（2）對數生長期：此期幾乎所有的細胞都在進行分裂，細胞數目迅速增長。其細胞倍增時間（TD）等于細胞周期時間（TC）長度。這一期常用細胞倍增時間及細胞分裂指數來判定。（3）平衡期（平坦期）這期細胞數目雖然在增加，但其增加速度在減慢，直至細胞數量不再增加，處于平衡狀態。

第49頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三5、細胞分裂指數指分裂期細胞在全部細胞中所占的百分率，用以表示細胞的增殖旺盛程度。一般要計算和觀察1000個細胞中的細胞分裂相數。第50頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三6、細胞貼壁率細胞貼壁率又稱接種存活率，用于觀察貼壁附著生長細胞，主要反映細胞的生存能力和部分底物材料的相容性。第51頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三7、細胞周期

細胞周期：一個細胞的分裂生長周期時間。

倍增時間：指在對數生長期細胞數量增加一倍所用的時間，這一時間內一般有些細胞參與分裂有些細胞可能不參與分裂，有些可能分裂兩次或數次，但細胞總數量增加1倍。第52頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三第四節細胞培養中常用的染色方法一、活體染色體外活體染色就是在體外條件下用某種染色劑（即活體染料）對活的組織或細胞進行染色，而不影響活細胞的生命活動的一種方法。利用這種方法，可以對培養物進行染色觀察，染色后的培養物還可以繼續進行培養。第53頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三1、活體染料的類別

堿性染料酸性染料中性紅，甲基蘭剛果紅，臺盼藍第54頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三2、染料排除檢測法第55頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三第四節細胞培養的污染與檢測污染是組織培養的大敵，避免污染的發生。污染一般包括微生物污染（細菌、真菌、支原體和病毒）、化學物（影響細胞生存的非細胞所需的化學成分）、細胞（非同種的其他細胞）。第56頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三一、污染途徑A.空氣措施：減少空氣流動B.器材措施：消毒徹底，洗刷干凈，定期消毒第57頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三C.操作措施：嚴格進行無菌操作，避免交叉感染D.血清E.組織樣本很難避免第58頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三二、污染對培養細胞的影響及檢測影響：細胞生長緩慢、分裂相減少、細胞變得粗糙、細胞輪廓增強、重者細胞停止增殖、分裂相消失、細胞質中出現大量堆積物、細胞變圓或崩潰從瓶壁脫落。第59頁，講稿共67頁，2023年5月2日，星期三A.細菌的污染及檢測取懸液培養，培養液顏色變黃，混濁