肺炎支原體抗體IgG金標(biāo)檢測試劑盒作業(yè)指導(dǎo)書1目的建立肺炎支原體抗體IgG金標(biāo)檢測試劑盒作業(yè)指導(dǎo)書，確保生產(chǎn)過程處于受控狀態(tài)。2范圍適用于肺炎支原體抗體IgG金標(biāo)檢測試劑盒相關(guān)工序的操作者。3職責(zé)3.1操作人員應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行本作業(yè)指導(dǎo)書。3.2生產(chǎn)主管負(fù)責(zé)監(jiān)督檢查。3.3質(zhì)檢部質(zhì)檢員負(fù)責(zé)抽查執(zhí)行情況。4工作內(nèi)容4.1生產(chǎn)工藝流程圖※膠體金制備膠體金制備★抗體檢測膠體金反應(yīng)膜檢測膠體金標(biāo)記抗體檢測膠體金反應(yīng)膜檢測膠體金標(biāo)記單克隆抗體制備進(jìn)單克隆抗體制備進(jìn)★貼板產(chǎn)品檢測裝卡分包質(zhì)量檢測切貼板產(chǎn)品檢測裝卡分包質(zhì)量檢測切條NC反應(yīng)膜檢測NC膜包被★NC反應(yīng)膜檢測NC膜包被抗原檢測肺炎支原體重組抗原的表達(dá)NC膜處理NC膜檢測※NC膜處理NC膜檢測入庫入庫抗體檢測兔抗鼠IgG抗體制備抗體檢測兔抗鼠IgG抗體制備注：※關(guān)鍵過程★特殊過程4.2作業(yè)內(nèi)容4.2.1膠體金制備（檸檬酸三鈉還原法）氯金酸（HAuCl4）水溶液放入三角瓶內(nèi)加熱至沸騰→加熱檸檬酸三鈉溶液→混勻，攪拌煮沸10至15分鐘→待膠體金溶液顏色由藍(lán)→紫→紅，冷卻即可。4.2.2金標(biāo)抗體（反應(yīng)膜）制備以0.1M碳酸鉀溶液調(diào)膠體金溶液pH8.0-9.0→加入抗人IgG單抗，15分鐘后加入聚乙二醇→離心，調(diào)532nm測OD值5～10，方陣滴定法選定標(biāo)記工作濃度→用無紡布浸濕膠體金溶液，干燥、平整，檢測。4.2.3金標(biāo)抗體反應(yīng)膜質(zhì)檢將制備好的金標(biāo)抗體反應(yīng)膜按5‰比例抽檢，與標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)膜匹配組裝成品，同時(shí)與標(biāo)準(zhǔn)成品作如下對照檢測：a)符合率：樣品稀釋液、陰性質(zhì)控血清無假陽性，陽性質(zhì)控血清均呈陽性；b)反應(yīng)強(qiáng)度：+/+++（陽性反應(yīng)線/陰性反應(yīng)線）；c)反應(yīng)時(shí)間：30s～5min。確認(rèn)合格后才能轉(zhuǎn)入下一工序。4.2.4NC反應(yīng)膜制備親和性高分子硝酸纖維素膜→活化處理12小時(shí)→用水洗5次，每次20分鐘→室溫干燥后→取純化Cpn重組肺支抗原和兔鼠IgG抗體溶于10%CS中，濃度均為2mg/ml，用Cpn重組肺支抗原在NC膜上包被肺支抗體陽性檢測線→用兔抗鼠IgG抗體在NC膜上包被對照線→干燥后，用BS液封閉，H2O清洗后，室溫干燥，備用。4.2.5NC反應(yīng)膜質(zhì)檢4.2.5.1常規(guī)圖形模式檢測：將制備好的反應(yīng)膜按5‰比例抽檢，與標(biāo)準(zhǔn)金標(biāo)抗體反映膜匹配組裝成品，同時(shí)與標(biāo)準(zhǔn)成品對照檢測；觀察陽性、陰性包被線及本底，要求圖形規(guī)則程度均勻，無遺漏或重復(fù)包被。4.2.5.2均一性、符合率篩選：按3%比例/批，隨機(jī)取樣，每張5～10人份，作陰性質(zhì)控品和肺支陽性血清的陽性質(zhì)控品檢測，無假陽性和假陰性，均一性≥98%4.2.6反應(yīng)體系組裝組裝材料材料規(guī)格（mm）組裝方式反應(yīng)膜（S1）20見圖1無紡布（S2）25，30吸水紙（S3）30金標(biāo)反應(yīng)膜（S4）10雙面膠帶（S5）29，48塑料墊板S678單面膠帶S7154.2.6.1反應(yīng)體組裝程序：a)在S6塑料基板上貼雙面膠帶S5（29，48mm）二條；b)在S5上貼反應(yīng)膜S1（20mm），S1上下緣距S6上下緣各29mm；c)在S6上貼吸水紙S3（30mm），吸水紙下緣與S1上緣交接1mm,上緣與S5的上邊緣對齊；d)在S5下端貼無紡布S2-1，其上緣壓住S1下緣1mm；e)在S2-1上平放金標(biāo)抗體反應(yīng)膜S4（10mm）上緣對齊；f)在S4上平放無紡布S2-2（30mm）上下緣分別S4、S6對齊；g)將組裝成型的反應(yīng)體系用電腦可調(diào)式切割機(jī)切成4.2mm測試條，裝入干燥器，待包裝。4.2.6.2成品包裝：每支成品先裝聚苯乙烯塑料外殼，再用鍍鋁膜包裝加干燥劑，附說明書，打批號入庫，每批留樣100人份，以備復(fù)檢．4.2.7參比品制備4.2.7.1肺支Ig-G陽性血清質(zhì)控品取臨床確診肺衣病人（臨床癥狀明顯、肺炎衣原體培養(yǎng)陽性）血清15份，間接ELISA測定肺炎衣原體IgM抗體陽性，0D492≥0.3，混合血清加防腐劑,分裝-70℃保存。4.2.7.2肺支Ig-G陰性血清質(zhì)控品取健康人血清（體查健康，培養(yǎng)法和間接ELISA測定肺炎支原體IgG抗體均陰性，0D492＜0.10）15份，混合血清加防腐劑,分裝-70℃保存。4.3成品檢測產(chǎn)品技術(shù)要求應(yīng)符合《肺炎支原體抗體IgG金標(biāo)檢測試劑盒》產(chǎn)品注冊標(biāo)要求。4.3.1外觀4.3.1.1要求檢測條：表面應(yīng)平整、無劃傷、開裂、變形及污漬；檢測卡各組分附著牢固、內(nèi)容齊全；b)檢測卡：外殼應(yīng)平整，上下蓋應(yīng)均勻合攏，無明顯間隙；反應(yīng)芯試條在外殼內(nèi)應(yīng)附著牢固；4.3.1.2檢驗(yàn)在自然光線下，用手感和目力觀察方法進(jìn)行檢驗(yàn)。4.3.2符合率4.3.2.1陰性符合率4.3.2.1.1要求試劑卡測試肺炎支原體IgG抗體陰性質(zhì)控血清10份，假陽性判斷結(jié)果不多于1份，符合率應(yīng)≥90%。4.3.2.1.2測試a)試劑1)樣品稀釋液；2)測定樣品液：肺炎支原體IgG抗體陰性質(zhì)控血清。b)測定方法隨機(jī)從同批待測試劑盒中抽取10個(gè)檢測卡，測定陰性質(zhì)控血清10份。測定時(shí)取10μl陰性質(zhì)控血清加在檢測卡加樣孔中，再加100μl樣品稀釋液，平放，等待3～5分鐘觀察檢測卡中部檢視窗的結(jié)果，但不可超過20分鐘讀結(jié)果。c)結(jié)果以下結(jié)果為合格：檢測線不顯色，只有對照線顯色。4.3.2.2陽性性符合率4.3.2.2.1要求試劑卡測試肺炎支原體IgG抗體陽性質(zhì)控血清10份，假陰性判斷結(jié)果不多于1份，符合率應(yīng)≥90%。4.3.2.2.2測試a)試劑1)樣品稀釋液；2)測定樣品液：肺炎支原體IgG抗體陽性質(zhì)控血清。b)測定方法隨機(jī)從同批待測試劑盒中抽取10個(gè)檢測卡，測定陽性質(zhì)控血清10份。測定時(shí)取10μl陰性質(zhì)控血清加在檢測卡加樣孔中，再加100μl樣品稀釋液，平放，等待3～5分鐘觀察檢測卡中部檢視窗的結(jié)果，但不可超過20分鐘讀結(jié)果。c)結(jié)果以下結(jié)果為合格：檢測線和對照線均顯色。4.3.3重復(fù)性4.3.3.1陰性重復(fù)率4.3.3.1.1要求使用試劑盒檢測同一份陰性質(zhì)控血清10次，同一份質(zhì)控血清的陰性判定結(jié)果應(yīng)基本一致，假陽性判定結(jié)果不多于1份，陰性重復(fù)率應(yīng)≥90%。4.3.3.1.2測定隨機(jī)從同批待測試劑盒中抽取10個(gè)檢測卡，測定時(shí)取10μl陰性質(zhì)控血清加在檢測卡加樣孔中，再加100μl樣品稀釋液，平放，等待3～5分鐘觀察檢測卡中部檢視窗的結(jié)果，但不可超過20分鐘讀結(jié)果。4.3.3.2陽性重復(fù)率4.3.3.2.2要求使用試劑盒檢測同一份陽性質(zhì)控血清10次，同一份質(zhì)控血清的陽性判定結(jié)果應(yīng)基本一致，假陰性判定結(jié)果不多于1份，陰性重復(fù)率應(yīng)≥90%。4.3.3.2.2測定隨機(jī)從同批待測試劑盒中抽取10個(gè)檢測卡，測定時(shí)取10μl陽性質(zhì)控血清加在檢測卡加樣孔中，再加100μl樣品稀釋液，平放，等待3～5分鐘觀察檢測卡中部檢視窗的結(jié)果，但不可超過20分鐘讀結(jié)果。4.3.4精密性4.3.4.1要求每批試劑盒隨機(jī)抽取10個(gè)檢測卡樣品，用同一份陽性質(zhì)控血清進(jìn)行檢測，要求各檢測卡的顯色應(yīng)均一。4.3.4.2測定隨機(jī)從同批待測試劑盒中抽取10個(gè)檢測卡進(jìn)行檢測。測定時(shí)取10μl陽性質(zhì)控血清加在檢測卡加樣孔中，再加100μl樣品稀釋液，平放，等待3～5分鐘觀察檢測卡中部檢視窗的結(jié)果，但不可超過20分鐘讀結(jié)果。4.3.5穩(wěn)定性4.3.5.1要求a）在37C條件下加速破壞試驗(yàn)放置1