關于微生物基因重組第1頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三目錄一、基因重組技術的歷史二、定義及原理三、主要步驟六、存在的問題及展望四、特點及其應用五、兩面性第2頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三一、基因重組技術的歷史

進入21世紀，面對石化資源、能源危機和環境危機日益加劇，以可再生生物資源為原料的生物技術產業展現出前所未有的競爭力，推動了工業菌株育種技術的發展。傳統育種技術工程量巨大，耗時長，且難于獲取復雜表型。近十幾年里，工業菌株改造主要集中在代謝工程。

該技術主要是運用現代基因手段，對微生物進行定向基因操作。雖然代謝工程育種較傳統育種取得了一定成果，但是基因型和表型相應背景的欠缺會限制其更廣范圍的利用?；蚪M重排技術是一種典型的全面組合技術手段，是全基因組代謝工程的延伸。第3頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三一、基因重組技術的歷史該方法由Stemmer在1994年提出的。DNAshuffling該方法是由Stemmer在1998年提出的。Genomeshuffling該方法是2002年由Zhang等在Nature上發表文章首次提出的?；蚪M重排技術—結合傳統育種技術將同源的DNA用DaseI進行消化成片段,然后將得到的隨機片段無引物PCR,使之重新隨機裝配,從而獲得了多種排列組合的突變基因庫,最后利用設計好的引物PCR,得到預期的重組體。

該方法是通過傳統誘變與原生質體融合技術相結合，對微生物細胞進行基因組重排，從而大幅度提高微生物細胞的正向突變頻率及正向突變速度，使人們能夠快速選育出高效的正向突變菌株。通過多親本之間的DNA重組和全基因組片段交換，將優良表型重組在一起的過程。第4頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三二、定義及原理定義

基因重組

基因重組技術PleasewritedownofcontentsexplanationforBusinessArea.是指由于不同DNA鏈的斷裂和連接而產生的DNA片段的交換和重新組合，形成新的DNA分子的過程。就是人類按照自身的需要和意愿，用類似工程設計的方式，將DNA在體外或體內進行組合，然后把組合后的DNA有目的的通過基因克隆、基因表達等方式形成人們所需要的新生物種或類型第5頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三二、定義及原理定義微生物n

基因重組微生物目前尚無權威性概念。專家于2007年1月在經充分討論后認為；是指運用遺傳學、基因工程和分子生物學技術，人工合成或對某種微生物的基因進行操作和修飾，并能表達、存活，從而使原有微生物的性狀、功能等發生變化，而產生的新的生物體。基因重組第6頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三二、定義及原理原理

Genomeshuffling是一項對整個微生物全基因組進行重排的定向育種技術，它把傳統微生物誘變育種技術與細胞融合技術結合，通過誘變手段獲得若干正性突變株，并采用細胞融合方式使之全基因組發生重組，經過遞推式多次融合，使基因組在較大范圍內發生交換和重排，將引起正性突變的不同基因重組到同一個細胞株中，最終獲得具有多重正向進化標記的目標菌株。第7頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三第8頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三三、主要步驟不同親本原生質體的選擇與制備一、誘導原生質體遞歸融合，每輪篩選的目的菌進入下輪融合二、根據目的表型需要設計特殊的選擇培養基，每輪篩選的融合菌株，進入下輪的融合三、第9頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三三、主要步驟一.親本菌株的選擇

親本菌株基因的多樣性可以擴大融合菌的基因型，在遞歸融合中促使不同優良表型匯集到融合菌中故基因組重排技術過程的首要任務是創造親本基因型的多樣性。一般手段是傳統誘變育種技術，使菌株產生更多的基因型。作為篩選親本菌株的一般準則是親本菌株必須具有理想的目的表型，如具備特殊環境高耐受力，產物高產率和菌株高生長率。、第10頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三三、主要步驟二.原生質體遞歸融合

基因組重排技術是基于原生質體融合技術之上的多輪遞歸融合。多輪遞歸融合確保了不同細胞之間的基因高轉移頻率，還保持了基因組重排的高效性。在原生質體遞歸融合過程中，首先要制備原生質體。制備原生質體主要參考的因素有菌齡、酶解濃度、酶解時間及溫度、酶的種類、脫壁輔助溶劑的選擇和滲透壓緩沖劑及再生培養基的設計等。遞歸融合的要義在于進行第一輪融合后篩選的融合菌株作為出發菌株，必須進入下輪融合。第11頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三三、主要步驟

目前，誘導原生質體融合的方式主要有生物病毒法，化學法和電處理融合法?；瘜W法和電處理融合法是當前最主要的方法。第12頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三三、主要步驟

隨著科學技術的不斷發展，一些新的工具開始運用于誘導細胞融合。Gong等用激光誘導紅發夫酵母進行細胞融合。Skelley等運用微流體芯片技術作為誘導細胞融合的技術平臺，明顯提高了融合效率。第13頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三三、主要步驟

三.融合子的篩選

目的融合菌的篩選與分離是整個基因組重排技術流程最為關鍵的步驟?；蚪M重排技術提高菌株對環境耐受性，可以方便設計含有高濃度的底物或產物的選擇培養基。第14頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三三、主要步驟

對于一些產酶的菌株可以采用較為直觀的方法,如水解圈法、燦爛綠法、瓊脂平板法等進行初篩,再對初篩獲得的優良菌株進行較精細的復篩。其中復篩可能會進行幾次，例如二次或三次復篩；并且每次復篩的方法都可能根據實驗的不同而有所不一樣。第15頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三三、主要步驟

對于其它菌株可以采用對某些條件的耐受性進行篩選,但對于一些生產周期長的產胞內次級代謝產物的菌株,仍沒有有效的篩選方法。目前已經開發了一些應用于DNA改組的高通量篩選方法,如:熒光激活細胞分類法，96孔板結合微板分光光度計進行高通量篩選。第16頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三三、主要步驟第17頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三四、特點及其應用

基因組重排技術充分結合了細胞工程和代謝工程的優勢，不僅可以進行菌種表型快速高效優化，還可為不同種類的微生物復雜的代謝和調控網絡提供了信息來源。第18頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三四、特點及其應用基因重組技術的特點能提高子代菌株的遺傳多樣性該技術簡單實用，容易推廣.無需菌種背景知識比傳統誘變選育更快速有效第19頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三四、特點及其應用（1）比傳統誘變選育更快速有效傳統誘變通常是將每一輪產生的突變體庫中篩選出的最優的1株菌作為下一輪誘變的出發菌株，而Genomeshuf-fling則是將一次誘變獲得的若干正性突變株共同作為出發菌株，經過遞推式的多輪融合實現較大范圍內的基因重組，效率更快更高，并可以基本避免誘變選育中因多次誘變導致的“鈍化”反應和“飽和現象”，在一定程度上克服了誘變選育存在的缺點

第20頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三第21頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三四、特點及其應用（2）能提高子代菌株的遺傳多樣性基因組改組技術源于原生質體融合技術，但兩者最大區別在于基因組改組技術使用多親本，而非雙親本，并且進行多輪遞推式融合，能產生各種各樣的突變組合，這將大大增加子代篩選群體內遺傳多樣性，從而提高了獲得優良性狀的菌株的幾率。第22頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三四、特點及其應用（3）該技術簡單實用，容易推廣。

應用該技術對設備要求不高，費用較低（一輪基因組改組的費用略相當于一輪理化誘變的費用），同時該技術易于實施，不需要對工業微生物基因的結構和功能作詳細了解，也不需要以工業微生物的代謝路線圖及其代謝調控機制等理論作基礎，因此，普通的育種工作人員在一般實驗室條件下就可以運用該技術開展相關實驗，容易廣泛推廣。第23頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三四、特點及其應用（4）無須對菌種遺傳背景十分清楚，有效地對由“多基因”調控的性狀進行改良。第24頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三

Genomeshuffling技術在工業微生物菌種選育中的應用四、特點及其應用第25頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三1Genomeshuffling技術改組細菌在乳酸發酵生產中，乳酸菌同時具有底物抑制和產物抑制的發酵特征，因此通過提高乳酸菌的耐糖性和耐酸性，進而提高乳酸產量是乳酸生產中的一個重要研究方向實例：于雷等對鼠李糖乳桿菌MEE539進行2輪基因組改組，獲得1株改組菌株F2-2，在含15%葡萄糖的YE培養基中搖瓶發酵36h產酸能達到135.6g/L，表明該改組菌在高糖條件下仍能有較高的產酸量，表現出很好的葡萄糖耐受性。第26頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三1Genomeshuffling技術改組細菌梁惠儀等從豆豉里面篩選得到1株具有纖溶酶活性的枯草芽孢桿菌DC-12，進行2輪基因組改組。從第1輪改組菌株中獲得6株正突變株，與原始菌株DC-12一起作為親本，進行第2輪改組篩選獲得5株酶活在1600U/mL以上（最高酶活2600U/mL）的正突變株，較親本菌株提高了4~5倍。表明在基因組改組過程中，結合原始菌株進行下一輪改組能獲得很好的效果。第27頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三2Genomeshuffling技術改組放線菌

朱惠等在改組納他霉素產生菌褐黃孢鏈霉菌SG-1的過程中，對常規的改組技術操作路線作了改進。將第1輪shuffling再生菌落（包括融合體和親本）不經過篩選，而直接用于制備原生質體后進行下一輪shuffling。最終仍篩選得到14株高產改組菌株，其中1株S.gilvosporeusGS-74的納他霉素產量為3574mg/L，是產量最高的親本菌株的1.5倍，比原始出發菌株SG-1提高1.17倍。改進后的技術路線既高效可行，又節省了時間和工作量，值得推廣。第28頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三2.3Genomeshuffling技術改組酵母菌

最近的研究表明，酵母菌耐高溫和耐酒精的生化機理十分復雜，涉及到大量的基因產物及其相關的代謝途徑因此用基因工程等正性育種手段，很難同時提高酵母菌的耐高溫和耐乙醇性能。王灝等以3株釀酒酵母菌f4、f5、f6作為出發菌株，分別進行原生質體紫外誘變，通過在不同溫度含不同乙醇濃度的一系列平板篩選，獲得耐高溫或耐乙醇性狀有較大提高的7株正突變菌株。以這些菌株作為出發菌株，進一步用硫酸二乙酯誘變，獲得了2株乙醇耐受性能較高的菌株。以上述9株優勢菌為出發菌株，進行2輪shuffling。第29頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三.3Genomeshuffling技術改組酵母菌

篩選獲得14株耐高溫和耐乙醇濃度都較出發菌株有了較大提高的菌株，期搖瓶發酵過程中發酵液中的最高乙醇濃度為12.93%vol，比原始出發菌株f4（35℃的發酵液中最高乙醇濃度8.11%vol）提高了約5%vol，證明通過Genomeshuffling的方法能將酵母菌耐高溫和耐高乙醇的性能集中于同一菌株，從而選育出既耐受較高溫度又耐受較高乙醇的菌株。該思路對于采用基因組改組技術選育同時具有多種性狀的優良菌株有指導意義，具有潛在的應用價值。第30頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三.4Genomeshuffling技術改組霉菌醬油是深受人們喜愛的大宗調味品，其釀造涉及到一個復合酶系，其中中性蛋白酶是主要的代表酶，因而提高菌種的中性蛋白酶酶活對醬油釀造是很有益的.李立風等對分離自曲精的曲霉BI進行2輪基因組改組，從第1、2輪shuffling的F1和F2代融合株中分別篩選到6株和7株酶活較高的菌株，分析發現F2代菌株的平均酶活更高，不過酶活最高的菌株是F1-103，表明在改組過程中，對于個體來說，優良表型的獲得有一定的不確定性，但是就整體而言，基因組改組過程中正性突變的累計效應是很明顯的。。第31頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三.4Genomeshuffling技術改組霉菌同時，該技術路線在原生質體滅活和融合等各個環節均體現出隨機性，以增加基因組交換和重組的機率，無形中增大了獲得優良菌株的概率，結果表明這種思路是可行的。第32頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三五、兩面性

第33頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三五、兩面性貢獻醫藥產業農業工業環境保護能源開發第34頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三21世紀人類進入知識經濟時代，隨著醫學科學、生物技術、藥學科學的發展，世界醫藥界將發生新的轉變，醫療模式將由治療為主向預防為主轉化，制藥將由以化學藥為主向生物技術藥物和天然產物綜合利用開發轉變，以生物技術開發未來藥物已成為制藥企業新藥開發的重要手段。增長最快的為基因重組藥物，疫苗居第2位，治療范圍包括腫瘤、類風濕關節炎等。從生物技術藥物制備及使用分析看，具有環境污染少、不受資源限制、臨床使用毒副作用低等特點，顯示了強大的生命力，將成為21世紀藥物市場重要的組成部分。1.醫藥產業第35頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三2.農業植物轉基因技術開辟了植物改良的新時代。自1983年人類首次獲得轉基因煙草和馬鈴薯以來，轉基因動、植物研究和開發勢不可擋。轉基因技術可提高育種目標的準確性，實現超遠緣育種，縮短一半育種時間。1986年轉基因農作物獲得批準進入田間試驗以來，截止2000年，經濟合作與發展組織(OECD)國家共批準10313例轉基因生物進入田間試驗，其中植物占總數的98.4%，細菌占1.0%，病毒占0.3%，真菌0.2%，動物占0.1%。第36頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三3.工業采用基因工程和蛋白質技術構“基因工程菌”，己經生產出許多可供人、畜食用的糖類、氨基酸、蛋白質、調味劑、食用色素、酒類等產品，在可再生資源的開發、清潔生產、控制污染，減少成本等方面起著重要作用，對于緩解“糧食問題”對土地的壓力具有重要意義。傳統發酵工業罐中，由菌種生產的發酵產品數量大、應用廣，對全球經濟影響十分巨大，例如抗生素、氨基酸、有機酸、酶制劑、醇類和維生素等。這些菌種基本上都經過長期的誘變或重組育種，生產性能很難再會大幅度提高。要打破這一局面，必須使用基因工程手段才能解決。目前在氨基酸、酶制劑等領域已有大量成功的例子。第37頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三4.環境保護在環境保護方面利用基因工程可培育同時能分解多種有毒物質的遺傳工程菌。這類新型遺傳工程菌在防治污染、保護環境方面有很大潛力。此外，通過DNA操縱得到不同類型的基因工程菌，可在貧礦中提取金屬。隨著人們環境保護意識的日益增強，生物農藥因其不污染環境、對人和動植物安全、選擇性強、不傷害害蟲天敵、害蟲難以產生抗藥性，而受到世界各國的高度重視，被譽為“綠色農藥”，是未來農藥發展的方向。微生物農藥在生物農藥中占有重要地位，它是利用微生物本身或其代謝產物防治病、蟲、雜草的制劑。已知的昆蟲微生物病原體1000多種，細菌1o多種，真菌750多種，其余為病毒、線蟲、原生動物等，這些病原體都可作為防治病蟲的資源開發利用。第38頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三5.能源開發生物能源將成為未來人類能源中的一個重要組成部分，目前利用微生物發電、制造氫氣、生物柴油和燃料乙醇已成為現實，成為解決未來能源問題的一條重要出路。美國、日本研究人員建構的“工程光合細菌”達到較高的產氫率，近幾年來，科學家已經發現30一40種化能異養菌可以發酵糖類、醇類、有機酸等，從而產生氫氣。在光合細菌中，人們發現了13一18種紫色硫細菌和紫色非硫細菌能夠產氫氣。據《大眾科技報》報道，早在1900年，英國植物學家發現有幾種細菌的培養液能夠產生電流，于是就以鉑作電極，放入大腸桿菌或普通酵母菌的培養液，成功地制造出世界上第一個細菌電池。1984年，美國科學家設計了一種可供太空飛船使用的細菌電池，其電極的活性物質是航天員的尿液和活細菌，不過這種裝置放電率較低。我國科學家也在實驗室成功的用異化金屬還原菌把有機酸和糖類物質所含有的能量轉化為電能。第39頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三基因治療的安全性問題對生物多樣性和環境的影響實驗室泄露或意外事故等安全隱患生物恐怖和生物武器的威脅“超級致病微生物”的出現五、兩面性可能引起的生物威脅第40頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三“超級致病微生物”的出現隨著生物高技術門檻的降低，微生物作為一類模式生物，除在醫藥、農業、工業等領域具有廣闊的應用前景外，對基礎研究的貢獻也十分重要。因此，許多實驗室都在開展微生物的基因重組和基因改造的研究工作，而在研究過程中，可能意外研制出威脅巨大的新型人工病原體。如2001年，澳大利亞科學家將白細胞介素4基因插入鼠痘病毒，意外發現該病毒可以導致實驗鼠的大量死亡，美國科學家在軍方的支持下改進了該實驗，可使疫苗失效，造成實驗動物全部死亡。第41頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三“超級致病微生物”的出現此外，隨著基因工程的不斷發展和廣泛應用，基因重組技術由于可以使動物、植物、微生物甚至人的基因進行相互轉移，轉基因生物已經突破了傳統的界、門概念，具有普通物種不具備的優勢特征，加之微生物具有代謝活躍、容易變異、繁殖快等特點，若釋放到環境，如發生基因漂移或載體介導的外源基因發生橫向轉移，重組出新的菌株，則可產生新的致病微生物。由于GEMs不斷地被釋放進入自然環境，而環境中微生物間的基因轉移十分普遍，以大腸桿菌為例，據估計其10一16%的遺傳物質源于基因轉移。第42頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三“超級致病微生物”的出現

有研究結果表明，在土壤中接種產乙醇的植生克雷伯菌sDF20可存活8周以上，它可以引起某些食真菌線蟲增長并導致引種的小麥死亡。還有報道表明，基因的轉移能夠在農作物與微生物之間自然發生。許多轉基因作物中都含有抗抗生素的基因，這些基因可能會隨著作物殘茬或共生作用而轉入細菌，從而使相應抗生素對這類細菌失去作用，導致“超級致病微生物”的出現而引起傳染病的暴發。第43頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三1234隨著科學技術的不斷發展，國際社會普遍認為生物恐怖和生物武器的潛在威脅已大大增加，其主要原因:是相對于核、化武器，生物武器研究和生產可繁可簡，成本低廉容易大批量生產，且隱蔽性高，攜帶方便，易于造成大面積恐慌。是以美國炭疽事件為標志生物恐怖對國際安全已經構成了現實威脅。是一些國家和地區可能仍在繼續研發生物武器。今后生物戰將會以人或動、植物的疫情突發為主要戰爭樣式。是生物技術的迅速發展大大增強了生物武器的潛在威脅，生物技術的發展使基因武器和種族基因武器成為現實。

生物恐怖和生物武器的威脅第44頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三實驗室泄露或意外事故等安全隱患微生物學實驗室管理上的疏漏和意外事故不僅可以導致實驗室工作人員的感染，也可造成環境污染和公眾感染。1990年后，世界各地有多個實驗室報道了“例布氏桿菌引起的實驗室感染，結核菌實驗室感染也較多。2000年美國2個實驗室各發生1例流行性腦膜炎球菌感染。2001年美國在“郵件事件”發現的炭疽芽抱粉末，根據其純度、粒徑及在空中漂浮分散的性能分析，應該來自于非常專業的實驗室。2003年9月、12月和2004年4月新加坡、臺灣和我國國家的專業實驗室均發生了SARS的實驗室感染。第45頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三對生物多樣性和環境的影響基因重組微生物由于經過遺傳修飾和改造，具有普通物種不具備的優勢特征，若釋放到環境，可能會改變物種間的競爭關系，破壞原有自然生態平衡和自然界的生物基因庫，對生物多樣性或環境產生危害。如基因工程作物的Bt持續而不可控制地產生大劑量的Bt毒蛋白，能大規模消滅害蟲，這就可能造成這些害蟲的天敵數量下降，威脅生態平衡。第46頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三對生物多樣性和環境的影響由于環保工程菌必須直接進入自然環境才能發揮作用，而基因改造后的用于環境治理的工程菌極易繁殖，極易進入其它生物體，且對極端環境的耐受力和發生變異的機率也較高，一旦釋放入自然環境將很難控制，隱藏著極大的危險性。例如利用工程技術制備的高效纖維素降解工程菌，對于造紙廢水治理是很有價值的，但如果不能確保這種工程菌只降解廢物而不降解有價值的原材料，將會給森林帶來災難性的后果。第47頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三用于基因治療的病毒載體目前尚未有載體導致靶細胞惡變的報道，但存在細胞毒作用引起免疫反應的可能，也可能發生突變而引起新的腫瘤。如腺病毒具有免疫原性，容易引起細胞和體液免疫反應。疙疹病毒(HSv)載體的基因表達產物對宿主細胞具有毒性，也會引起嚴重的免疫反應?；蛑委煹陌踩詥栴}第48頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三五、兩面性基因重組微生物生物安全威脅的特點(一)生物安全威脅的不確定性1.生物安全威脅性質和來源的不確定性2.生物安全威脅的判斷的不確定性3.生物安全威脅應對機制(管理機制)的不確定性第49頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三五、兩面性(二)生物安全威脅的擴散難以預防1.生物技術的兩用性2.管理機制的不統一性(三)生物安全威脅造成的危害難以消除1.基因污染難以消除2.生物危害具有長期性第50頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三特點及其應用

Genomerearrangementshavebeenstudiedin30c-proteobacterialcompletegenomesbycomparingtheorderofareducedsetofgenesonthechromosome.Thissetincludedthosegenesfulfillingseveralcharacteristics.第51頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三應用舉例

Theduplicatedgeneevolvedfasterthantheoriginalgene,probablyleadingtoaspecializationoffunctionoftheduplicatedcopy.第52頁，講稿共58頁，2023年5月2日，星期三六、存在的問題及展望仍然存在的問題：基因組重排技術應用菌種改良，由于基因組片段重組也是隨機的并不具備定向性，如何高效篩選目的表型融合菌存在著一定的困難和挑戰?；蚪M重排技術目前普遍運用于同種雙親細胞內，對于不同種