魚(yú)和肉的鮮三甲胺和組胺結(jié)構(gòu)分析氧化三甲胺

氧化三甲胺分子式為(CH3)3NO,(TrimethylamineN-oxide,TMAO)其化學(xué)結(jié)構(gòu)與甲基供體膽堿、甜菜堿和S-腺苷甲硫氨酸等相似。

氧化三甲胺廣泛分布于海水動(dòng)物產(chǎn)品肌肉中,具有特殊的鮮味。一般海水硬骨魚(yú)含100-1000mg/100g,海水軟骨魚(yú)中含700-1400mg/100g，淡水魚(yú)中含量很少，一般在10mg/100g。氧化三甲胺廣泛分布于海產(chǎn)硬骨魚(yú)類的肌肉中,但在體內(nèi)的分布并不均勻。鰭、肌肉肌節(jié)的頭部和尾部含量特別高。在黑肉色的魚(yú)中,紅肌中氧化三甲胺含量比白肌中高;而在白肉色魚(yú)中情況卻相反。氧化三甲胺的生理功能氧化三甲胺作為動(dòng)物體內(nèi)重要的無(wú)毒中間代謝物,氧化三甲胺是一種蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑和有機(jī)滲透劑,參與海生硬骨魚(yú)和某些廣鹽性硬骨魚(yú)等的滲透調(diào)節(jié),在水產(chǎn)業(yè)中具有廣闊應(yīng)用前景。三甲胺的產(chǎn)生1.氧化三甲胺是魚(yú)鮮美味道的主要來(lái)源,氧化三甲胺極不穩(wěn)定,魚(yú)死后，在腐敗細(xì)菌尤其是兼性厭氧菌（如互生單孢菌、腐敗極毛菌）的作用下,很容易還原成三甲胺。氧化三甲胺是一種鮮味物質(zhì)含量與鮮度密切相關(guān)。2.魚(yú)類的紅肌中含有內(nèi)源性的氧化三甲胺還原酶。Fe2+

在氧化三甲胺轉(zhuǎn)變?yōu)槿装泛投装?DMA)中起重要的作用。在Fe2+

、血紅蛋白和半胱氨酸存在下，4℃氧化三甲胺轉(zhuǎn)變?yōu)槿装泛投装贰?/p>

2Cys＋2Fe3＋→Cys－Cys＋2Fe2＋＋2H＋

Me3NO＋2H＋＋

2Fe2＋→Me3N＋2Fe3＋＋H2O3.氧化三甲胺一經(jīng)加熱就會(huì)分解，罐頭及其它海水魚(yú)加工中常有此反應(yīng)。Me3NO→Me3N＋HCHO4.水產(chǎn)動(dòng)物中的卵磷脂經(jīng)微生物分解產(chǎn)生三甲胺，但量較少。－CH2OP－OCH2CH2－N（CH3）3三甲胺含量－鮮度指標(biāo)隨著魚(yú)的新鮮程度的不斷降低,魚(yú)體內(nèi)的三甲胺不斷增加,魚(yú)的腥味也不斷變濃。鑒于此,可以把三甲胺的測(cè)定值作為魚(yú)類腐敗情況的一個(gè)重要質(zhì)量控制參數(shù)三甲胺有氧化三甲胺生成。最初1936年Beatty建議用三甲胺作鮮度指標(biāo)。國(guó)內(nèi)郭大釣等人以馬面鲀?yōu)樵希沧C實(shí)了這一結(jié)果指標(biāo)：TMA4-6mg%新鮮，6-10mg%不新鮮，TMA20-30mg%腐敗。

三甲胺-氮的測(cè)定苦味酸比色法GB/T5009.179-2003中華人民共和國(guó)火腿衛(wèi)生國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

苦味酸比色法

一、原理：將三甲胺抽提于無(wú)水甲苯中，與苦辣酸作用，形成黃色的苦味酸三甲胺鹽，于410nm下有最大吸收。然后與標(biāo)準(zhǔn)管同進(jìn)比色，即可測(cè)得檢樣中三甲胺氮含量。

苦味酸三甲胺性質(zhì):易溶于甲苯溶液中,以分子狀態(tài)存在。在水溶液中以離子狀態(tài)存在410nm加入甲醛的目的：消除氨的干擾6HCHO＋4NH3→(CH2)6N4+6H2O二、試劑

1、

20%三氯乙酸溶液。2、甲苯：試劑級(jí)，用無(wú)水硫酸鈉脫水，再用1N硫酸振搖、蒸餾，除干擾物質(zhì)，最后再用無(wú)水硫酸鈉脫水使其干燥。3、苦味酸甲苯溶液：

儲(chǔ)備液：將2g干燥的苦味酸（試劑級(jí)）溶于100mL無(wú)水甲苯中，使其成為2%苦味酸甲苯溶液。

應(yīng)用液：將儲(chǔ)備液稀釋成為0.02%苦味酸甲苯溶液即可用。4、

1:1碳酸鉀溶液。

5

、10%甲醛溶液：先將甲醛用碳酸鎂振搖處理并過(guò)濾，然后稀釋成為10%濃度。

苦味酸比色法三、儀器25mLMaijelGerson反應(yīng)瓶。721型光電比色計(jì)。

苦味酸比色法四、操作方法1、檢樣外理：取被檢肉樣20g（視檢樣新鮮程度確定取樣量）剪細(xì)研勻，加水70mL，提取后過(guò)濾。加20%三氯乙酸10mL，振搖，沉淀蛋白后過(guò)濾，濾液即可供測(cè)定用。2、呈色反應(yīng)：萃取：取濾液5mL于反應(yīng)瓶中，加10%甲醛溶液1mL，甲苯10mL及1：1碳酸鉀溶液3mL，立即蓋上塞，上下劇烈振搖60次，靜置20min。吸去下面水層，加入無(wú)水硫酸鈉約進(jìn)行脫水。苦味酸比色法比色反應(yīng)：吸出5mL甲苯萃取液于預(yù)先已置有0.02%苦味酸甲苯溶液5mL的試管中，輕輕搖動(dòng)，混合均勻，在410nm處或用藍(lán)色濾光片測(cè)得吸光度，并做一空白試驗(yàn)。苦味酸比色法3.標(biāo)準(zhǔn)曲線：配置鹽酸三甲胺（試劑級(jí)）約為％，用微量或半微量凱氏蒸餾法準(zhǔn)確測(cè)定三甲胺-氮量。再稀釋成10ug/mL的三甲胺-氮，作為儲(chǔ)備液用。準(zhǔn)備吸取后稀釋標(biāo)準(zhǔn)液、、、、（相當(dāng)于10ug、20ug、30ug、40ug、50ug）于25mLMaijelGerson反應(yīng)瓶中，加蒸餾水中至，按上法同樣測(cè)定，確定三甲胺-N與光密度制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。苦味酸比色法

樣品實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線（10ug/mL的三甲胺－氮）mL

提取

濾液5mL01.02.03.04.05.0水5.04.03..02.01.0010%甲醛溶液1mL甲苯10mL1：1碳酸鉀溶液3mL蓋上塞，上下劇烈振搖60次，靜置吸去下面水層，加入無(wú)水硫酸鈉約0.5g進(jìn)行脫水。

呈色反應(yīng)取5mL甲苯提取溶液＋5mL苦味酸甲苯溶液(0.02%)

比色410nm比色五、計(jì)算：

C——相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)的三甲胺-氮質(zhì)量，μg;

W——檢樣質(zhì)量，g;

V1——檢樣后體積，mL

V2——稀釋后體積，mL。

氣敏電極法氣敏電極法三甲胺是魚(yú)和貝類腐敗時(shí)產(chǎn)生的一種氣體,其含量大小能直接反映魚(yú)和貝類的新鮮程度,1980年代末日本就開(kāi)始研制用氣體傳感器測(cè)量三甲胺含量來(lái)判斷海魚(yú)和貝類新鮮程度的方法。八十年代,我國(guó)東海為尋求更簡(jiǎn)單的測(cè)定方法，參考George等的實(shí)驗(yàn)，采用國(guó)產(chǎn)的氣敏電極改裝成TMA特效電極（即TMA氣敏電極），試驗(yàn)TMA和其他其它胺類的相應(yīng)情況，并且與苦味酸鹽比色法的回收率進(jìn)行比較。一、原理氣敏電極是七十年代發(fā)展起來(lái)的離子交換電極，是將指示電極(離子選擇性電極)與參比電極裝入同一個(gè)套管中,做成一個(gè)復(fù)合電極，實(shí)際上是一個(gè)化學(xué)電池。該電極由最外層憎水性透氣膜,只允許使電極響應(yīng)的氣體擴(kuò)散通過(guò)，而不允許溶液中的離子通過(guò)。內(nèi)充0.01TMA·HCl鹽和混合溶液。溶液中氣體擴(kuò)散直至膜內(nèi)外兩邊分壓相同為止。試驗(yàn)品中的氣體分壓與溶液濃度成正比。此時(shí)，TMA特效電極以奈斯特關(guān)系反應(yīng)TMA的濃度變化，這種變化可以通過(guò)測(cè)量此特效電極與內(nèi)參電極見(jiàn)得電勢(shì)差而獲得測(cè)試樣中濃度的定量值。氣敏電極法二、儀器和試劑PNH3氨氣敏電極;6511型電動(dòng)恒溫?cái)嚢杵鱐MA·Cl標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.00×10-1mol/L)氣敏電極法三、試驗(yàn)方法1、取10克魚(yú)肉加200mL水，用高速組織搗碎機(jī)搗碎，稱取50克魚(yú)肉漿，加37％甲醛攪拌均勻后，抽濾。2、取10克魚(yú)肉提取液在50mL容量瓶中，加37％甲醛0.25mL和，加水稀釋到刻度，振蕩均勻，在室溫下放置3分鐘。氣敏電極法測(cè)定前此液顛倒數(shù)次，倒入50mL燒杯中，磁力攪拌片刻，停止攪拌后當(dāng)液體不轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)，讀取其毫伏值。當(dāng)電位在1min內(nèi)變化不超過(guò)1mV時(shí),即認(rèn)為讀數(shù)已達(dá)到平衡(一般為2～5min)3、工作曲線的繪制

1.00×10-6～1.00×10-2mol/LTMA·HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液10mL,37％甲醛和同樣方法測(cè)定，繪制濃度與毫伏值的工作曲線。最低檢出限為5.00×10-6mol/L氣敏電極法銨離子的工作曲線氣敏電極法四、實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該注意的事項(xiàng)1、共存物質(zhì)苯、苯酚、甲苯、二甲基萘、吡啶、喹啉等均無(wú)干擾。而揮發(fā)性胺類(如乙胺)的存在有明顯的干擾。

Fe3+、Al3+、Cu2+

離子等在堿性溶液中生成沉淀,在低濃度的氨溶液中引起電位偏離。為消除其影響,加入EDTA溶液以消除其干擾。2、電極電位受溫度影響較大，在20～30℃范圍內(nèi)，dE/dT值在0.5mV左右,因此樣品測(cè)定溫度應(yīng)和工作曲線測(cè)定時(shí)的溫度盡可能相同，測(cè)定溫度不要低于15℃,否則會(huì)影響響應(yīng)時(shí)間氣敏電極法第三節(jié)組胺的檢測(cè)組胺的產(chǎn)生在青皮紅肉魚(yú)中（金槍魚(yú)、鮐魚(yú)、鳀魚(yú)），所含組氨酸在弱酸性條件下經(jīng)細(xì)菌的作用后（摩爾根變形桿菌、組胺無(wú)色菌），脫羧產(chǎn)生組胺。組胺是一種過(guò)敏性毒物，對(duì)組胺過(guò)敏的人，吃了一口含組胺的魚(yú)就可能引起反應(yīng)。中毒癥狀臉紅、頭暈、頭痛、口肉麻木、眼部充血、蕁麻疹、心跳加快，胸悶呼吸急促等。人體中毒約。發(fā)病時(shí)間快，一般在10分鐘到3小時(shí)內(nèi)，發(fā)病率較高（30％左右），但是癥狀較輕，恢復(fù)也較快，多在翌日可自行痊愈。標(biāo)準(zhǔn)：水產(chǎn)品組胺含量不超過(guò)52mg%組胺的檢驗(yàn)重氮鹽比色法有色化合物480nm

呈色反應(yīng)一、原理

重氮鹽的形成：甲：對(duì)硝基苯胺，加濃鹽酸5mL，溶解后，加水至200mL，冰箱儲(chǔ)存。乙：亞硝酸鈉，加水溶解至100mL（現(xiàn)用現(xiàn)配）二、儀器與試劑

10%三氯乙酸:25%氫氧化鈉重氮鹽試劑：甲：對(duì)硝基苯胺克，加濃鹽酸5mL，溶解后，加水至200mL，冰箱儲(chǔ)存。乙：亞硝酸鈉克，加水溶解至100mL（現(xiàn)用現(xiàn)配）組胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:準(zhǔn)確稱取在硫酸干燥器中干燥24h的磷酸組胺27.67mg(分析純)，用水溶解并定容至100mL容量瓶中。該溶液每毫升含組胺1mg。組胺標(biāo)準(zhǔn)使用液:準(zhǔn)確吸取組胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于500mL容量瓶中，用水定容至刻度，該溶液每毫升含組胺為10ug。三、試驗(yàn)方法1、樣品處理除去樣品中的非可食部分，將樣品搗碎、混勻，準(zhǔn)確稱取1-5g于50mL具塞三角瓶中中，加人20mL三氯醋酸(10%)，在60℃水浴中浸提30min，過(guò)濾。殘?jiān)盟?次(每次加水10mL)并過(guò)濾，合并濾液。用氫氧化鈉溶液(250g/L)中和濾液至，再用水定容至100mL.2.抽提：正戊醇抽提：取濾液1mL于分液漏斗中，加入25％NaOH使其呈堿性。再加入3mL正戊醇，振搖分層提取，然后取正戊醇層。酸液提取：取正戊醇液1mL，至于另一個(gè)漏斗中，加入3mLHCl（1mol/L），混合均勻，靜止5分鐘，分層，取下層鹽酸溶液。重復(fù)提取3次，合并提取液。水層：堿液正戊醇層：組胺酸液層：組胺的鹽酸鹽正戊醇層3.呈色反應(yīng)：取鹽酸提取液于10ml比色管，加入3mLNa2CO3(5%)，偶氮試劑3mL，混勻，用水稀釋至10mL，混合后放置10分鐘，在480nm測(cè)光密度。4、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取組胺標(biāo)準(zhǔn)使用液0、、、、、，各加1mLHCl(1mol/L)、3mLNa2CO3(5%)、偶氮試劑3mL。同樣操作，測(cè)定吸光值。確定組胺濃度與吸光值的關(guān)系曲線。計(jì)算4.實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度：本法測(cè)定水產(chǎn)品中組胺含量，簡(jiǎn)單、快速、易操作。日間與日內(nèi)精密度實(shí)驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.01%-2.90%。回收率在90%一110%之間，方法的重現(xiàn)性與準(zhǔn)確度好。第四節(jié)次黃嘌呤與K值魚(yú)類的肌肉運(yùn)動(dòng)必須依靠三磷酸腺苷(ATP)轉(zhuǎn)化提供能量，而魚(yú)體死后其體內(nèi)所含ATP按下列途徑分解:ATP→ADP(二磷酸腺苷)→AMP(磷酸腺苷)→IMP(肌苷酸)→HxR(肌苷)→Hx(次黃嘌呤)一、次黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶法以次黃嘌呤為指標(biāo)確定水產(chǎn)品的鮮度，黃魚(yú)100－200ppm為新鮮，鯧魚(yú)100－250ppm為新鮮，河鯽魚(yú)小于50ppm為新鮮。2,6一二氯靛酚次黃嘌呤pH7.6緩沖液黃嘌呤氧化酶尿酸波長(zhǎng)600nm?A/?T（一）原理：（二）試驗(yàn)試劑2,6一二氯靛酚溶液：用磷酸緩沖液配制成23ug/mL黃嘌呤氧化酶溶液：活力單位/mL黃嘌呤氧化酶法（三）試驗(yàn)方法1.樣品處理：測(cè)定時(shí)取樣10g，用0.6mo1/L高氯酸40mL攪拌提取，過(guò)濾。取濾液25mL，用KOH調(diào)至，將高氯酸鉀沉淀過(guò)濾，然后用磷酸緩沖液（pH7.6）定容至50mL。黃嘌呤氧化酶法2.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取次黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)液（40ug/mL），各至于1cm比色皿中，→加入磷酸緩沖液至總體積5.8mL→加2,6一二氯靛酚溶液lmL→最后加黃嘌呤氧化酶溶液0.2mL，立即混勻，于600nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。→在讀數(shù)時(shí)在加酶后30秒后讀取2-3min即可，以最初的2-3min內(nèi)讀取的光密度計(jì)算反應(yīng)速度(?A/?T)→標(biāo)準(zhǔn)曲線：次黃嘌呤濃度－反應(yīng)速度?A/?T關(guān)系的。黃嘌呤氧化酶法3.樣品測(cè)定：加樣品液1mL于lcm比色杯中，加2,6一二氯靛酚溶液lmL，加磷酸緩沖液2mL，加次黃嘌呤氧化酶溶液0.2mL，立即混勻，于600nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。以最初的2-3min內(nèi)讀取的光密度計(jì)算反應(yīng)速度(吸光度變化/min)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣品中次黃嘌呤的含量。黃嘌呤氧化酶法二、K值魚(yú)類的肌肉運(yùn)動(dòng)必須依靠三磷酸腺苷(ATP)轉(zhuǎn)化提供能量，而魚(yú)體死后其體內(nèi)所含ATP按下列途徑分解:ATP→ADP(二磷酸腺苷)→AMP(一磷酸腺苷)→IMP(肌苷酸)→HxR(肌苷)→Hx(次黃嘌呤)K值是以核苷酸的分解產(chǎn)物作為指標(biāo)的鮮度判定方法K值與揮發(fā)性鹽基氮的區(qū)別重點(diǎn)因?yàn)閯?dòng)物一旦生命活動(dòng)停止，因?yàn)楹怂崾呛铣傻鞍踪|(zhì)的密碼，核酸比蛋白質(zhì)分解得早，所以ATP的降解早于蛋白質(zhì)的降解。ATP的降解作用就開(kāi)始，伴隨著次黃嘌呤等降解產(chǎn)物的生成。此時(shí)蛋白質(zhì)還沒(méi)有開(kāi)始分解。當(dāng)ATP的降解產(chǎn)物次黃嘌呤和黃嘌呤濃度很高時(shí)，揮發(fā)性鹽基氮還很低。K值是反映水產(chǎn)品鮮度的指標(biāo)。當(dāng)揮發(fā)性鹽基氮的含量較高時(shí)，水產(chǎn)品往往鮮度就比較差，因此揮發(fā)性鹽基氮的含量是表示水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)的指標(biāo)。K值越小表明產(chǎn)品越新鮮。K值作為評(píng)價(jià)魚(yú)類新鮮度的化學(xué)指標(biāo)應(yīng)用較準(zhǔn)確，尤其適合對(duì)魚(yú)類早期鮮度的評(píng)定，許多學(xué)者建議將K值作為評(píng)定魚(yú)類鮮度的指標(biāo)。一般新鮮魚(yú)的K值為10以下。K值的測(cè)量方法有高效液相色譜法(HPLC)、極譜法、離子柱層析簡(jiǎn)易測(cè)定法。目前認(rèn)為高效液相色譜法較好

（一）液相色譜的測(cè)定：1.高效液相色譜儀條件：色譜柱：ODSC18分離柱(octadecylsilyl十八烷基硅烷柱)流動(dòng)相：2PO4－K2HPO4(pH6.6)，流速：1mL/min。檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm，靈敏度。進(jìn)樣量：10uL。標(biāo)準(zhǔn)：以1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)ATP、ADP、AMP、IMP、HxR、Hx進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定。得到標(biāo)準(zhǔn)核苷酸色譜分離譜圖。2.樣品處理：取魚(yú)肉粉碎，準(zhǔn)確稱取1g置于10mL離心試管中，加入冰冷的10%高氯酸2mL，用玻璃棒攪拌，離心，取上清液。用10mol/LKOH中和至pH為，沉淀部分離心除去，用冰水洗滌沉淀，最后用冷高氯酸定容至10mL。上液相分析，確定每一種核苷酸的含量3.計(jì)算：K值（％）=(HxR+Hx)/(ATP+ADP+AMP+IMP+HxR+Hx)×100（二）快速液相色譜據(jù)大島敏明等將鯉魚(yú)、鱒魚(yú)以快速的液相色譜測(cè)定K值。液相色譜條件液相柱：u-BondapakC18不銹鋼柱（waters,1″*1/4″內(nèi)徑）洗脫液：0.05mol/L(NH4)2HPO4–EtOH(95:5)，流速。紫外：250nm。標(biāo)準(zhǔn)：以1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)ATP、ADP、AMP、IMP、HxR、Hx等體積混合，進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定。在－5min的保留時(shí)間內(nèi)，可以出現(xiàn)三個(gè)峰。第一個(gè)峰P1代表ATP、ADP、AMP及IMP的混合物的峰P2第二和三個(gè)峰分