代謝控制發酵基本技術應用第一節：誘變

一、誘變的概念和程序誘變：就是利用物理或化學因素處理微生物細胞群體，使其中少數細胞的遺傳物質的結構發生變化，從而引起微生物的遺傳性狀發生變化，然后通過目的選擇標記設法從群體中篩選出少數性狀優良的突變菌株的過程。誘變程序：出發菌株純化制備菌體懸浮液誘變劑處理中間培養目的突變菌株分離初篩復篩生產性試驗二、誘變劑1．誘變劑的概念：能夠顯著地提高微生物突變頻率的理化因素2．誘變劑的種類：一般有下列兩大類：物理誘變劑：紫外線、X射線、r射線、快中子、激光、超聲波等。化學誘變劑：亞硝酸、烷化劑、羥胺、硫酸二乙酯（DES）、亞硝基胍（NTC）、重氮化合物等3．紫外線誘變原理：DNA分子強烈吸收紫外線，可引起DNA的斷裂、DNA分子內部和分子間的交聯、核酸與蛋白質的交聯、嘧啶水合作用及形成嘧啶二聚體等。誘變方法：(1)在誘變處理前，開啟紫外燈，預熱20min，使光波穩定。(2)將10m1細胞懸浮液置于滅過菌的并帶有磁力攪拌棒的直徑的培養皿中，放置在磁力攪拌器的載物臺上，紫外線照射10min進行培養皿的表面消毒(3)開啟磁力攪拌器，打開皿蓋(4)照射一定時間后，蓋上皿蓋，將培養皿取出，取1m1處理液稀釋涂平板或中間培養。4．亞硝酸誘變原理：亞硝酸可以使堿基氧化脫氨，使AH、CU、GX，從而改變了原來的堿基配對關系，引起突變。誘變方法：

(1)配制緩沖液及亞硝酸溶液滅菌備用。2)取細胞懸浮液2m1，加入2，加入醋酸緩沖液,27C保溫處理一定時間。(3)取2m1處理液，加入pH8.6的NaH2PO4溶液，調整PH值為7，誘變作用終止。(4)適當稀釋后徐平板或進行中間培養。5．烷化劑誘變原理：烷化劑能與核苷酸分子中的磷酸基，堿基起烷化作用，或與DNA分子作用造成DNA的損傷。誘變方法：以硫酸二乙酯(DES)為例

(1)菌懸液制備將細菌接入肉湯培養基中，振蕩培養過夜。離心收集體，將細胞懸浮于磷酸緩沖液中，制成細胞濃度為108個／mI的菌懸液。(2)取4ml菌懸液，加入磷酸緩沖液，加入，30℃

處理一定時間。(3)取1m1處理液，放入20ml肉湯培養基中培養過夜或直接稀釋徐平板。三、誘變育種中的幾個問題1．出發菌株的選擇A出發菌株應對誘變劑敏感、變異幅度大。B利用野生型菌株。C選用經自發突變篩選得到的菌株。D利用回復突變或基因重組后的菌株。E選擇單倍體細胞。F選擇單核或細胞核盡量少的細胞。2．細胞懸浮液的制備A同步培養。B選擇對數生長期細胞。C細胞懸浮液：真菌孢子和酵母菌濃度為106個/ml，細菌營養細胞和放線菌孢子濃度為108個/ml。D細胞懸浮液的制備：物理誘變劑用生理鹽水配制，化學誘變劑用緩沖液配制。3．誘變劑的選擇及處理方法的的選擇A誘變劑的選擇B誘變劑量的選擇C誘變處理方法的選擇4．中間培養突變基因的出現并不意味著突變表型的出現，表型的改變落后于基因型改變的現象，稱為表型延遲。其原因有分離性延遲和生理性延遲兩種。為了克服表型延遲，必須將經誘變處理的菌液進行中間培養，即將一定量的菌液接入完全液體培養基中培養過夜。四、突變型菌株的分離1．營養缺陷型菌株的分離A營養缺陷型菌株的濃縮目的：選擇性地除去經中間培養后群體細胞中的野生型細胞方法：青霉素法、D-環絲氨酸法、五氯酚法、亞硫酸法、制霉菌素法、6-脫氧葡萄糖法、過濾法、差別殺菌法等。B營養缺陷型菌株的檢出目的：檢出營養缺陷型菌株方法：逐個檢出法、夾層檢出法、限量補充培養法、影印接種法等C營養缺陷型菌株的鑒定目的：鑒定突變菌屬哪種物質缺陷型方法：在基本培養基上放置含有氨基酸、維生素、核酸水解物的濾紙片，進行培養。

逐個檢出法夾層檢出法影印接種法等2．抗性突變菌株的分離A抗藥性突變菌株的分離B結構類似物抗性突變菌株的分離3．溫度敏感突變菌株的分離4．產量性狀突變菌株的分離第二節：原生質體融合一、概念與流程概念：將兩個遺傳性狀不同的細胞融合為一個新細胞流程：篩選標記菌株制備原生質體

原生質體再生原生質體融合融合子的選擇篩選實用菌株二、標記菌株的篩選一般選營養缺陷型或抗藥性等遺傳性狀作為遺傳標記三、

原生質體的制備A菌體前處理加入一些化學物質，使菌體的細胞壁對酶的敏感性增加。B菌體的培養時間選擇對數生長期菌體。C酶濃度酶濃度過低，不利于原生質的形成，酶濃度過高，導致原生質體再生率降低，必須選擇最適酶濃度D酶解溫度溫度高，有利于酶反應速度；溫度增加，酶易變性失活。必須選擇最佳酶解溫度，一般在20-40℃。

E酶解時間時間長，細胞去壁完全，時間過長，酶會對原生質體發生作用，是細胞質膜損傷，造成原生質體破裂,從而使原生質體失活，必須選擇合適的酶解時間。F滲透壓穩定劑高滲透壓，保護原生質體，有助于酶與底物的結合因此，一般采用滲透壓穩定劑使其維持在高滲透壓條件。滲透壓穩定劑有：細菌用蔗糖、丁二酸鈉、NaCl等，酵母菌用甘露醇、山梨醇等，霉菌用NaCl，KCl等。穩定劑使用濃度在～。四、原生質體的再生細胞破壁后得到的原生質體應具有再生能力，但由于已經損失細胞壁，不能在普通培養基上生長，必須想辦法使其細胞壁生長。再生培養基必須與原生質體內的滲透壓相等，因此再生培養基必須使用滲透壓穩定劑。

五、

原生質體融合僅將原生質體等量混合，融合頻率很低。一般融合時使用融合促進劑。融合促進劑采用表面活性劑PEG（聚乙二醇）。影響原生質體融合的因素主要有：1．融合劑濃度：PEG用量過低，原生質體破裂，失去穩定性；過高，原生質體收縮而降低融合頻率，一般PEG用量為30-40%。2．融合時間：因PEG在高濃度下有毒，融合時間不能過長。3．陽離子濃度：Ga2+濃度在為好，Na+、K+會降低融合頻率。4．

PH值：堿性條件能刺激產生最大融合頻率。5．紫外線：采用紫外線照射原生質體再進行融合，可大大提高融合頻率。六、融合子的選擇遺傳物質融合后形成的細胞叫融合子。融合子有真正的融合，有暫時融合，前者穩定。要獲得真正的融合子，必須在融合原生質體再生后，進行分離、選擇。融合子的選擇可采用，可采用鈍化法。

第三節：轉導

一、轉導的概念轉導作用是利用轉導噬菌體為媒介，將供體菌的部分DNA導入受體菌中，使受體菌獲得部分遺傳性狀的過程。轉導作用的實現，必須有供體、轉導噬菌體、受體菌三部分存在。二、轉導方法

1、制備轉導噬菌體供體菌培養至對數生長期加入噬菌體繼續培養氯仿殺菌離心除菌體菌體裂解液轉導噬菌體

2、轉導受體菌培養至對數生長期加入轉導噬菌體離心收集菌體選擇培養基培養第四節：轉化

一、轉化的概念從供給遺傳物質的供體細胞中取出遺傳物質，通過對接受遺傳物質的受體細胞的培養處理，供體DNA片斷進入受體內，與受體細胞的DNA重組,從而使受體細胞獲得供體細胞部分遺傳性狀而獲得雜種的方法叫轉化育種二、轉化的方法1．

供體DNA的制備供體菌培養溶菌酶處理SDS、苯酚處理，使蛋白質變性離心水相加冷乙醇DNA絮狀沉淀波棒取出供體DNA2．受體細胞對DNA的吸收

A將受體菌株在內湯培養基中培養到對數生長初期、離心收集茵體，懸浮在等體積的生長培養基中，在37℃振蕩培養到對數生長期的中后期，離心.B將菌體懸浮在等量或稍少的轉化培養基中轉化。轉化時，在試管中加入一定的DNA掖、受體菌液和轉化培養基，37℃振蕩培養60分鐘，進行轉化

C轉化后，按照一定的遺傳標記在基本培養基中檢出，并作進一步試驗。

3．轉化過程與條件

A轉化過程細菌轉化大體過程是感受態的出現、DNA的吸附、DNA進入細胞內、DNA解鏈、形成受體DNA—供體DNA復合物和DNA復制分離等幾個階段。其中感受態的出現是個重要的關鍵。

B感受態的出現細胞能從周圍環境吸取DNA分于使之不被DNA酶破壞時的細胞生理狀態稱為感受態。一個菌株能否出現感受態，不但由其遺傳特性決定，而且環境條件和細胞本身的生理狀態也起著作用。

CDNA吸附

DNA進入感受態細胞之前，要經過可逆和不可逆的吸附。可逆吸附時，吸附了的DNA對DNA酶敏感，不可逆吸附時，雖然對DNA酶不敏感，但在DNA進入細胞前，由于DNA吸附在細胞膜外面，若用溶菌酶處理，就會抑制轉化。感受態細胞與DNA的親和性與DNA片斷大小有關。例如分子量從30萬一800萬的DNA，肺炎球菌細胞與最大分子量的DNA親和性最大，活性最高，分子量在30萬以下就不表現轉化活性。

DDNA的摻入

DNA只能摻到感受態細胞中，一般是雙鏈DNA摻人，也有單鏈摻入的，這時的DNA活性較大。熱、冷、洗、溶菌酶等對DNA的摻入有一定的影響，DNA進入細胞后，大部分在細胞膜上。

E供體DNA和受體DNA復合物的形成

DNA進入細胞馬上取出，并不表現生物學活性，要經過幾分鐘后才恢復其活性，并形成供體DNA和受體DNA的復合物。兩股單鏈都可以倂入受體DNA，但性狀的表現快慢有差別，倂人的DNA平均分子量約為2×106

。轉化育種的應用目前尚不普遍，還有一定困難，主要是在可轉化的種屬中并不是所有菌株都可轉化。因此從非感受態細胞中建立一個獲得感受態細胞的簡便有效方法很為登要。由于感受態是受多基因控制的，因此困難參一些，此外，還要注意DNA酶對轉化的影響。當然要提高轉化頻率，還要考慮合適的轉化培養條件。第五節：雜交一、雜交的概念利用不同變種的細胞與細胞的結合、染色體的交換及基因重組來獲得優良菌種的過程二、霉菌的雜交

霉菌雜交的過程實際上就是借助其準性生殖循環過程中的基因重組和分離，把兩株具有不同優點的菌種結合成一株新的菌種的過程。

1．親本的選擇作為青霉菌直接親本的遺傳標記有多種：形態突變型、營養缺陷型、抗藥性突變型、抗生素產量突變型。當前應用營養缺陷型最為普遍2．異核體的形成在基本培養基上，使兩營養缺陷突變株強迫互補營養，則兩菌株經過茵絲細胞間的吻合形成異核體，即在一條菌絲里含有兩個遺傳性狀不同的細胞核，共同生活在均一