樹突狀細胞疫苗在人源化裸鼠體內的抗腫瘤免疫保護作用【摘要】目的探討樹突狀細胞疫苗在人源化裸鼠體內的抗胃癌免疫保護作用。方法制備DCRNA疫苗；建立人源化裸鼠模型；15只人源化裸鼠隨機分為DCRNA組、DCs組和PBS組，每組5只，分別用DCRNA、DCs和PBS皮下免疫注射2次，間隔1周，末次免疫后3天皮下接種胃癌細胞。各組裸鼠外周血人源性CD4﹢T細胞和CD8﹢T細胞的檢測和觀察GVHD反應。觀察裸鼠瘤體積和瘤重。檢測細胞因子IL12和IFNγ水平。結果各組HuPBTL裸鼠外周血中均檢測到人源性CD4﹢T細胞和CD8﹢T細胞，無GVHD反應。DCRNA組瘤體積明顯小于DCs組和PBS組；DCRNA組瘤重明顯小于DCs組和PBS組，但DCs組和PBS組差異無統計學意義；DCRNA組抑瘤率顯著高于DCs組。DCRNA組IL12和IFNγ水平明顯高于DCs組和PBS組。結論HuPBTL腹腔注射，可成功構建裸鼠人細胞免疫功能；DCRNA疫苗在人源化裸鼠體內能誘導產生較強的抗胃癌免疫保護作用。

【關鍵詞】樹突狀細胞；疫苗；胃癌；裸鼠；人源化；細胞免疫

樹突狀細胞是體內功能最強的抗原提呈細胞，在誘導特異性抗腫瘤細胞免疫反應中起關鍵作用。近年來，國外DCs疫苗Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗治療惡性膠質瘤[1]、腎癌和結、直腸癌等，說明DCs疫苗是安全可行的。我們前期的實驗結果已經證實胃癌總RNA轉染的DCs在體外誘導產生抗胃癌特異性CTL，在此基礎上，我們觀察胃癌總RNA轉染的DCs在人源化裸鼠體內抗胃癌免疫保護作用。

1材料和方法

材料

胃癌細胞株BGC823，由河北醫科大學申海濤博士惠贈。BALB/c裸鼠購于中國醫學科學院實驗動物研究所，SPF級，4～5周齡，體重18～20g，均為雌性。飼養于河北省實驗動物中心SPF級動物實驗室，籠具、水和墊料均高壓消毒，每3天更換1次。RPMI1640培養基購于美國Gibco公司，新生牛血清購于杭州四季青生物工程材料有限公司。RPMI1640完全培養基：以RPMI1640培養基為基礎，加10%滅活的新生牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素。重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子、重組人白細胞介素4均為美國Reprotech公司產品。TRIzol試劑購于美國Invitrogen公司。FicollPaque淋巴細胞分離液購于瑞典AmershamBiosciences公司。尼龍毛購于日本和光純藥工業株式會社。人IL12和IFNγ水平檢測ELISA試劑盒為深圳晶美生物工程有限公司產品。FITC/PE標記鼠抗人單抗CD4、CD8購于美國BioLegend公司。

方法

細胞BGC823培養和胃癌總RNA的提取和鑒定BGC823常規培養、消化傳代，取對數生長期細胞用于實驗。消化、離心收集細胞，PBS洗滌3次，按TRIzol試劑盒說明書抽提胃癌總RNA，取少量RNA測定OD260/OD280，計算總RNA含量和純度；瓊脂糖變性電泳可見完整18S、28S兩條帶，表明總RNA完整未降解。調細胞BGC823濃度為1×107/ml。

DCs的培養及DCRNA疫苗制備的健康成人外周血行密度梯度離心法分離出外周血單個核細胞，PBS洗滌3次，在完全培養基，37℃、5%CO2飽和濕度培養箱培養2h后，吸出未貼壁細胞；留下的貼壁細胞，流式細胞儀檢測其純度，調整細胞密度為2×106/ml，加入6孔板中，每孔加完全培養基、rhGMCSF100ng/ml和rhIL450ng/ml，37℃、5%CO2飽和濕度培養箱培養，隔天半量換液及添加rhGMCSF和rhIL4。參考文獻的方法，第5天，將imDCs分成2組，1組imDCs用RPMI1640培養基調整密度為1×107/ml，加總RNA50μg/ml，在37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中共培養60min進行轉染，轉染結束后更換培養基繼續培養2天；另1組繼續培養2天作為對照組。第7天收集全部懸浮和輕微貼壁細胞，PBS洗2次，調整其密度為5×106/ml。

人源化裸鼠模型的建立和DCRNA疫苗抗胃癌免疫保護作用將吸出的非貼壁細胞，完全培養基懸浮后輕輕注入尼龍毛柱，37℃水浴1h，沖洗出非貼壁細胞即為人T淋巴細胞，FCM檢測其純度，PBS洗滌2次，調整細胞密度為6×107/ml。15只裸鼠腹腔注射人T細胞3×107/只，建立HuPBTL裸鼠模型。隨機分為DCRNA組、DCs組和PBS組，每組5只，分別用DCRNA、DCs和PBS皮下注射，免疫2次，間隔1周，末次免疫后第3天于裸鼠右腋窩中部外側皮下接種胃癌細胞2×106/。成瘤后每2天用游標卡尺測量瘤體最長徑a、最短徑b。觀察各組裸鼠腫瘤生長速度、瘤體積和瘤重，TV=×a×b2，抑瘤率=/對照組平均瘤重×100%。

移植物抗宿主病反應和裸鼠人細胞免疫重建成功的檢測觀察實驗期間裸鼠的體重變化，有無皮疹、腹瀉、步態改變等表現；實驗結束時處死裸鼠，立即摘眼球將外周血置于含有EDTA的抗凝管中并混勻，FCM檢測人源性CD4+T細胞和CD8+T細胞。

細胞因子IL12和IFNγ水平的檢測采用尼龍毛柱法分離免疫裸鼠的脾T淋巴細胞。以BGC823細胞作為刺激細胞，加入50μg/ml的MMC，37℃，滅活30min。將T細胞和滅活的BGC823細胞以10∶1混合，培養48h后收集上清液，采用ELISA法檢測上清液中IL12和IFNγ水平。

統計學分析實驗數據用±s表示，應用統計軟件，采用單因素方差分析，P＜為差異有統計學意義。

2結果

各組裸鼠人細胞免疫重建成功的檢測和GVHD反應

各組HuPBTL裸鼠外周血中均檢測到人源性CD4﹢T細胞和CD8﹢T細胞，見圖1。各組裸鼠體重無明顯變化，無皮疹、腹瀉等。

不同組荷瘤鼠腫瘤體積、瘤重及抑瘤率的比較

DCRNA組瘤體積明顯小于DCs組和PBS組，差異有統計學意義，見圖2。DCRNA組瘤重g明顯小于DCs組g和PBS組g，但DCs組和PBS組差異無統計學意義；DCRNA組抑瘤率明顯高于DCs組，差異有統計學意義。

細胞因子IL12和IFNγ水平的檢測

DCRNA組IL12和IFNγ水平明顯高于DCs組和PBS組，見表1。表1各組細胞因子IL12和IFNγ水平的比較注：*與PBS組比較t=、P＜；▲與DCs組比較t=、P=；#與PBS組比較t=、P＜；△與DCs組比較t=、P=

3討論

裸鼠先天缺乏細胞免疫，為解決研究人體腫瘤免疫的動物模型不能確切反映人體免疫系統的這個問題，我們借鑒了建立HuPBLSCID鼠嵌合體模型的經驗[7，8]，腹腔注射人外周血T淋巴細胞以重建裸鼠的細胞免疫，建立人源化裸鼠模型，即HuPBTL裸鼠嵌合體，較好地模擬了人體的免疫微環境。鑒定裸鼠體內人細胞免疫重建成功的最簡單方法是FCM檢測裸鼠外周血或淋巴器官人源性T細胞特異性標記CD3﹢T細胞或其亞群CD4﹢T細胞和CD8﹢T細胞。本實驗各組裸鼠外周血中均檢測到人源性CD4﹢T細胞和CD8﹢T細胞，提示腹腔注射HuPBTL可在裸鼠體內成功重建人的細胞免疫系統，且未發現GVHD。隨著DCs疫苗策略的不斷改進，有必要對疫苗進行臨床前動物實驗以評價其有效性和安全性，HuPBTL裸鼠嵌合體模型的建立為DCs疫苗研究和在同一系統內比較、評價疫苗療效奠定了實驗基礎。

移植瘤可激活SCID鼠內重建的人免疫系統發生抗腫瘤免疫應答，疫苗有助于免疫反應。本實驗結果顯示，DCRNA疫苗組荷瘤鼠皮下移植瘤與DCs組和PBS組相比，其生長速度明顯減慢，抑瘤率明顯大于DCs組，提示重建的人細胞免疫系統已在裸鼠體內發生了抗腫瘤免疫應答，抑制移植瘤生長，DCRNA疫苗對胃癌生長有明顯的抑制作用，能增強荷瘤鼠的抗腫瘤免疫應答。這是由于轉染胃癌總RNA的DCs成熟度增高，能更有效地將腫瘤抗原提呈給T細胞，激活腫瘤特異性CTL具有殺傷作用，有利于清除腫瘤細胞或遠處器官的微轉移，同時CTL具有記憶效應，再次接觸同種抗原時大量活化擴增，能有效抵抗胃癌細胞攻擊。DCRNA疫苗免疫的裸鼠，其IL12和IFNγ水平明顯增加，而且IL12有較強的殺傷腫瘤細胞和抗腫瘤轉移的作用[10]。DCRNA疫苗對人胃癌有較強的免疫保護作用，可能是特異性免疫和非特異性免疫共同作用的結果，為DCRNA疫苗應用于胃癌免疫預防的臨床研究和預防胃癌術后復發、轉移提供了實驗依據。

【參考文獻】

［1］CarusoDA,OrmeLM,NealeAM,etal.ResultsofaphaseIstudyulilizingmonocytederiveddendriticcellspulsedwithtymorRNAinchildrenandyouthadultswithbraincancer“[J“].Neurooncol,2004,6(3):236246.

“[2“]S