第三章微載體培養技術演示文稿本文檔共50頁；當前第1頁；編輯于星期三\10點6分最初采用在培養液中加入一定數量的小滾瓶，增加細胞生長的貼壁面積。此方法構造簡單，成本低，重復性好，放大過程可依靠滾瓶數量的增加。但產率低，勞動強度大，占空間大。如何增加細胞生長的貼壁面積？微載體系統本文檔共50頁；當前第2頁；編輯于星期三\10點6分1967年被用于動物細胞大規模培養。兼具懸浮培養和貼壁培養的優點，放大容易。現廣泛用于培養各類細胞，生產疫苗、蛋白質產品。微載體培養系統培養4h，微載體間的細胞“橋聯”×200

電鏡下串在一起的肝細胞微載體×730由于肝細胞的粘附作用微載體形成“串珠”×400

脊髓灰質炎、狂犬和乙腦等疫苗本文檔共50頁；當前第3頁；編輯于星期三\10點6分二、微載體的商品類型第一種微載體：

VanWezel用DEAE-SephadexA50研制而來市售（國際）種類有十幾種以上：液體微載體、大孔明膠微載體、聚苯乙烯微載體、PHEMA微載體、甲殼質微載體、聚氨酯泡沫微載體、藻酸鹽凝膠微載體以及磁性微載體等常用商品化微載體有三種：Cytodex1、2、3，Cytopore和Cytoline本文檔共50頁；當前第4頁；編輯于星期三\10點6分顯微鏡下的高密度微載體本文檔共50頁；當前第5頁；編輯于星期三\10點6分優良的微載體應具有的特性價廉，能重復使用。不含能毒害細胞的成分；微載體須與細胞有良好的相容性；密度應略大于培養基；粒徑在40～120μm范圍，生理鹽水溶脹后增大到60~250μm，粒度分布地均勻，徑差不大于20~25μm；良好的光學透明性；能在PBS中耐120~125℃、20~30min高溫滅菌；應是非剛性材料；不吸收培養基中的營養成分；收獲細胞或細胞制品容易，不影響蛋白質分離純化；本文檔共50頁；當前第6頁；編輯于星期三\10點6分三、微載體培養原理與操作

1、原理：將對細胞無害的顆粒——微載體加入到培養容器的培養液中，作為載體，使細胞在微載體表面附著生長，同時通過持續攪動使微載體始終保持懸浮狀態。絲網微載體通氣的培養基鼓泡器攪拌葉輪微載體培養裝置圖本文檔共50頁；當前第7頁；編輯于星期三\10點6分●微載體的大小：增大單位體積內表面積（S/F）對細胞的生長非常有利。使微載體直徑盡可能小，最好控制在100-200μm之間。

●微載體的密度：一般為2，隨著細胞的貼附及生長，密度可逐漸增大。●微載體的表面電荷：據研究，控制細胞貼壁的基本因素是電荷密度而不是電荷性質。若電荷密度太低，細胞貼附不充分，但電荷密度過大，反而會產生“毒性”效應。本文檔共50頁；當前第8頁；編輯于星期三\10點6分細胞能否黏附，主要取決于細胞與微載體的接觸概率和相融性。細胞增殖階段：黏附貼壁、生長和擴展成單層；貼壁依賴性細胞在微載體表面上：貼附是進一步鋪展和生長的關鍵，主要是靠靜電引力和范德華力；本文檔共50頁；當前第9頁；編輯于星期三\10點6分Vero細胞在Cytodex-3微載體表面粘附鋪展的形貌變化本文檔共50頁；當前第10頁；編輯于星期三\10點6分通常做法：貼壁期采用低攪拌轉速，時攪時停；數小時后，待細胞附著于微載體表面時，維持設定的低轉速，進入培養階段。微載體培養的攪拌非常慢，最大速度75r/min。2、攪拌轉速：動物細胞無細胞壁，對剪切力敏感，無法靠提高攪拌轉速來增加接觸概率。本文檔共50頁；當前第11頁；編輯于星期三\10點6分攪拌速率越大，制得的微球越小，聚合物濃度越大，制得的微球較大以聚己內酯（PCL）、聚左旋乳酸（PLLA）、聚乙醇酸聚乳酸共聚物（PGLA）為基質制備可生物降解微載體本文檔共50頁；當前第12頁；編輯于星期三\10點6分3、細胞與微載體的相融性：與微載體表面理化性質有關。一般細胞在進入生理pH值時，表面帶負電荷。若微載體帶正電荷，則利用靜電引力可加快細胞貼壁速度。若微載體帶負電荷，因靜電斥力使細胞難于黏附貼壁，但培養液中溶有或微載體表面吸附著二價陽離子作為媒介時，則帶負電荷的細胞也能貼附。本文檔共50頁；當前第13頁；編輯于星期三\10點6分(a)MCC細胞，未經處理的Cytodex-3表面；(b)MCC細胞，用纖粘連蛋白處理后的Cytodex-3表面(c)Vero細胞，未經處理的Cytodex-3表面；(d)Vero細胞，用層粘連蛋白處理的Cytodex-3表面(e)Vero細胞，用纖粘連蛋白處理的Cytodex-3表面細胞（Vero和MCC）在不同外源基質處理的（Cytodex-3）微載體上貼附本文檔共50頁；當前第14頁；編輯于星期三\10點6分4、細胞在微載體表面的生長的影響因素

細胞方面：細胞群體、狀態和類型。微載體方面：微載體表面狀態、吸附的大分子和離子；微載體表面光滑時細胞擴展快，表面多孔則擴展慢。培養環境中：培養基組成、溫度、pH、DO以及代謝廢物等均明顯影響細胞在微載體上的生長。如果所處條件最優，則細胞生長快；反之生長速度慢。

本文檔共50頁；當前第15頁；編輯于星期三\10點6分微載體系統培養細胞的步驟：(1)選擇合適的微載體類型(2)浸泡水化及消毒(3)接種(4)培養觀察與細胞記數(5)消化(6)分離細胞(7)傳代培養本文檔共50頁；當前第16頁；編輯于星期三\10點6分交聯葡聚糖為基質微載體纖維素為基質微載體蛋白質為基質微載體（變性膠原微載體:蛋黃色，表面特性好，易與細胞結合）高分子材料為基質微載體無機玻璃基質微載體

微載體基質本文檔共50頁；當前第17頁；編輯于星期三\10點6分PCL微球表面多皺，PLLA微球表面布滿坑洞，PGLA微球表面光滑不同種類聚酯的微球表面形貌差異本文檔共50頁；當前第18頁；編輯于星期三\10點6分多孔載體培養優點:降低血清用量，增加細胞固定性。生長空間大，免受機械損傷，可以提高攪拌強度和通氣量，強化傳質；多孔載體不僅能培養貼壁細胞，也適合懸浮細胞的固定化連續灌流培養；多孔載體固定細胞過程簡單，對細胞無毒害和損傷，細胞可從長滿細胞的微載體中自動轉移到未長細胞的新載體上生長，接種方便，培養簡單，特別適合于反應器大規模培養。本文檔共50頁；當前第19頁；編輯于星期三\10點6分多孔載體制備的材料選擇(1)生物相容性：材料對細胞必須無毒害，對貼壁細胞有良好的黏附作用；(2)機械穩定性：微載體在長時間攪拌狀態下不破碎；同時滿足微載體清洗處理、回收利用的要求。(3)熱穩定性：在121℃、蒸汽滅菌下不分解、不破碎、不軟化。主要考慮生物相容性、機械穩定性和熱穩定性本文檔共50頁；當前第20頁；編輯于星期三\10點6分5、微載體培養操作要點

●培養初期：保證培養基與微球體處于穩定的pH與溫度水平，接種細胞（對數生長期）至終體積1/3的培養液中，以增加細胞與微載體接觸的機會。不同的微載體所用濃度及接種細胞密度不同，常使用2-3g/L的微載體含量，更高的微載體濃度需要控制環境或經常換液。

本文檔共50頁；當前第21頁；編輯于星期三\10點6分貼壁階段（3-8d）后，緩慢加入培養液至工作體積，并且增加攪拌速度保證完全均質混合。本文檔共50頁；當前第22頁；編輯于星期三\10點6分●培養維持期：進行細胞計數（胞核計數）、葡萄糖測定及細胞形態鏡檢；隨著細胞增殖，微球變得越來越重，需增加攪拌速率；經過3d左右，培養液開始呈酸性，需換液：停止攪拌，讓微珠沉淀5min，棄掉適宜體積的培養液，緩慢加入新鮮培養液（37℃），重新開始攪拌。本文檔共50頁；當前第23頁；編輯于星期三\10點6分

●收獲細胞：首先排干培養液，至少用緩沖液漂洗1遍，然后加入相應的酶，快速攪拌（75-125r/min）20-30min。然后解離收集細胞及其產品。本文檔共50頁；當前第24頁；編輯于星期三\10點6分●微載體培養的放大：可以通過增加微載體的含量或培養體積進行放大。使用異倍體或原代細胞培養生產疫苗、干擾素，已被放大至4000L以上。本文檔共50頁；當前第25頁；編輯于星期三\10點6分細胞形態飽滿、生長良好細胞形態更加立體，輪廓清晰，細胞數量明顯增加，少量微載體上細胞幾乎長滿微載體上細胞基本長滿，細胞形態健康微載體上細胞更加致密，細胞密度達到5×106個/ml以上微載體上細胞依然良好，沒有明顯細胞脫落現象

Marc145細胞微載體培養第1天

Marc145細胞微載體培養第2天

Marc145細胞微載體培養第3天

Marc145細胞微載體培養第4天

Marc145細胞微載體培養第10天本文檔共50頁；當前第26頁；編輯于星期三\10點6分四、微載體培養優點

●培養系統占地面積和空間小。●表面積/體積大，因此單位體積培養液的細胞產率高；●把懸浮培養和貼壁培養融合在一起，兼有兩者的優點；●可用簡單的顯微鏡觀察細胞在微珠表面的生長情況；●簡化了細胞生長各種環境因素的檢測和控制，重現性好；●培養基利用率較高；●放大容易；●細胞收獲過程不復雜；●勞動強度小；本文檔共50頁；當前第27頁；編輯于星期三\10點6分傳統方法——疫苗生產的流感病毒在雞胚內培養生產過程：對幾百萬個蛋胚逐一接種和收獲，很難自動化、勞動強度大、時間消耗多，且有污染的可能。BaxterBiomedical研究中心，奧地利如今——大規模微載體培養Vero細胞生產流感疫苗成為可能馴化Vero細胞適應在用于大規模生產的無血清無蛋白培養基內生長。中試生產中最終的生物反應器規模是1200升。包括工藝設計，特殊的通氣和攪拌裝置，可以進一步放大到生產體積為6000升。關于H1N1疫苗生產本文檔共50頁；當前第28頁；編輯于星期三\10點6分流感疫苗生產的大規模生產區域(A)細胞培養(B)離心分離(C)超濾、洗濾。本文檔共50頁；當前第29頁；編輯于星期三\10點6分Vero細胞流感疫苗生產圖(A)未感染的細胞(B)早期細胞病變影響(C)收獲前的晚期細胞病變大規模流感病毒生產中細胞病變影響圖片本文檔共50頁；當前第30頁；編輯于星期三\10點6分本章講授到此，謝謝！本文檔共50頁；當前第31頁；編輯于星期三\10點6分何謂微載體？指直徑在60-250μm，能適用于貼壁細胞生長的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各種合成的聚合物組成。原理：

將對細胞無害的顆粒-微載體加入到培養容器的培養液中，作為載體，使細胞在微載體表面附著生長，同時通過持續攪動使微載體始終保持懸浮狀態。回想一下：本文檔共50頁；當前第32頁；編輯于星期三\10點6分

一、微囊法（microencapsulation）:

用一層親水的半透膜將細胞包圍在珠狀的微囊里，細胞不能逸出，但小分子物質及營養物質可自由出入半透膜；囊內是種微小培養環境，與液體培養相似，能保護細胞少受損傷，故細胞生長好、密度高。第四章動物細胞的微囊化培養本文檔共50頁；當前第33頁；編輯于星期三\10點6分圖4－1微膠囊示意圖微膠囊膜生物大分子代謝產物細胞營養物質本文檔共50頁；當前第34頁；編輯于星期三\10點6分二、研究發展歷程1、首次報道生物活性物質的微囊化研究（1957）：

將酶、蛋白質和激素等生物活性物質包封在選擇性透過膜中，形成球狀微膠囊,稱之為“生物微膠囊”。通過微膠囊膜的選擇透過作用,使囊外大于某一分子量的物質不能擴散進入,而生物環境中的營養成分和囊內生物活性物質或細胞分泌的小分子產物可以自由出入微膠囊,從而達到免疫隔離目的。本文檔共50頁；當前第35頁；編輯于星期三\10點6分2、“人工細胞”——“人工胰腺”80年代初,Lim等人將微囊化技術與組織細胞移植相結合,制備了海藻酸鈉/聚賴氨酸(APA)微膠囊,包埋豬胰島細胞形成“人工細胞”,并移植入糖尿病大鼠體內,結果成功地調節了血糖水平,代行了大鼠胰腺功能,因而被稱為“人工胰腺”。該成果較好地解決了組織細胞移植過程的免疫排斥問題,避免或減少了昂貴的免疫抑制劑的使用,為組織細胞移植治療神經/內分泌系統疾病提供了新思路。本文檔共50頁；當前第36頁；編輯于星期三\10點6分3、90年代以來,醫學界開始嘗試以微膠囊作為基因重組細胞的免疫隔離和運載工具,利用重組細胞的代謝產物調節機體生理功能,治療相關疾病。微囊化人胰島培養15d微囊化小牛腎上腺嗜鉻細胞培養10d微囊化肝癌細胞培養40d本文檔共50頁；當前第37頁；編輯于星期三\10點6分4、目前，微膠囊的應用研究涉及藥物控制釋放、動植物細胞培養、細胞和酶的固定化以及生化物質分離等領域,已經成為材料、化學、化工、生物和醫學等多學科領域工作者的研究熱點。

SEM下微膠囊的顯微形貌×200LSCM下微膠囊表面形貌的照片本文檔共50頁；當前第38頁；編輯于星期三\10點6分不同放大倍數的海藻酸鈣微膠囊的SEM照片不同放大倍數的殼聚糖/海藻酸鈉微膠囊的SEM照片本文檔共50頁；當前第39頁；編輯于星期三\10點6分三、性質：曾是酶固定化技術中的一種（半透膜將酶包裹在球狀的微囊里，酶及大分子不能從微囊里透出，而小分子物質可自由通過膜）。動物細胞微囊化后，與游離細胞相比，降低了培養時對細胞的剪切力，同時也能提供很高的細胞密度，使得產物濃度增加，純度提高。動物細胞微囊化培養的成功為干擾素、乙肝表面抗原(HBsAg)、單克隆抗體(MAb)等的產生提供了廣泛應用前景。

本文檔共50頁；當前第40頁；編輯于星期三\10點6分表4－1微膠囊制備材料

來源類型材料天然脂質卵磷脂、神經鞘髓磷脂等多糖海藻酸鹽、殼聚糖、瓊脂、淀粉等蛋白質明膠、白蛋白、纖維蛋白半合成纖維素類衍生物羧甲基纖維素鈉、已基纖維素、醋酸纖維素及其酯等合成可降解型乳酸/乙醇酸共聚物、聚正酯、聚內酯、聚酐、聚烷基氰基丙烯酸酯、聚氨基酸非降解型聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酰胺、聚酰胺、聚苯乙烯、乙烯醋酸乙酯共聚物、聚氯乙烯等本文檔共50頁；當前第41頁；編輯于星期三\10點6分制備方法化學法界面聚合法、乳化法、輻射化學法物理化學法相分離法、溶劑蒸發法、界面沉積法、噴霧干燥法物理法靜電沉積法、氣相沉積法、流化床噴霧包衣法圖2制備方法使用率比較

1－－乳化法，2－－靜電法，3－－聚合法，4－－沉積法，

5－－相分離法，6－－噴霧干燥法，7－－溶劑蒸發法本文檔共50頁；當前第42頁；編輯于星期三\10點6分

四、

微囊化培養技術要點:操作：在無菌條件下將擬培養的細胞、生物活性物質及生長介質共同包裹在薄的半透膜中形成微囊,再將微囊放入培養系統內進行培養；生長介質為1.4%海藻酸鈉溶液,半透膜由多聚賴氨酸形成；培養系統可采用攪拌式或氣升式反應器系統；微囊直徑控制在200-400μm為宜。本文檔共50頁；當前第43頁；編輯于星期三\10點6分五、動物細胞微囊化的制備主要是應用海藻酸—聚氨基酸的方法簡單過程：動物細胞與海藻酸溶液混合攪拌，經過微囊發生器將微球滴入氯化鈣(cacl2)溶液中，形成凝膠，然后再用聚氨基酸處理，使微球表面成膜，最后用檸檬酸處理去除微球內的鈣離子，以便球內的海藻酸成液態，動物細胞得以懸浮在其中。動物細胞的微囊化中海藻酸和聚氨基酸是關鍵材料。本文檔共50頁；當前第44頁；編輯于星期三\10點6分針頭CaCl2液微珠磁力攪拌器（微囊發生器）海藻酸/細胞懸浮液聚氨基酸檸檬酸本文檔共50頁；當前第45頁；編輯于星期三\10點6分聚賴氨酸/海藻酸微囊化步驟：1.懸浮細胞膠狀液；2.成滴器；3.膠化小珠；4.包被溶液；5.顯微鏡下微囊；6.多孔微囊膜；7.完成操作后的微囊。本文檔共50頁；當前第46頁；編輯于星期三\10點6分

制備注意事項