酵母雙雜交(自激活)第一頁，共十五頁，編輯于2023年，星期五真核生物的轉錄因子是由兩個可以分開的、功能上相互獨立的結構域(domain)組成的。一、原理酵母的轉錄激活因子GAL4，在N端有一個由147個氨基酸組成的DNA結合域(DNAbindingdomain,BD)，C端有一個由113個氨基酸組成的轉錄激活域(transcriptionactivationdomain,AD)。第二頁，共十五頁，編輯于2023年，星期五

GAL4分子的BD可以同上游激活序列(upstreamactivatingsequence,UAS)結合。

AD則能激活UAS下游的基因進行轉錄。單獨的BD和AD都不能激活UAS的下游基因，它們之間只有通過某種方式結合在一起才具有完整的轉錄激活功能。第三頁，共十五頁，編輯于2023年，星期五第四頁，共十五頁，編輯于2023年，星期五第五頁，共十五頁，編輯于2023年，星期五His,β-gal第六頁，共十五頁，編輯于2023年，星期五一般情況下，單獨的BD可以與GAL4上游活化序列（GALUAS）結合，但不能引起轉錄。然而，將一段具有轉錄激活活性的轉錄因子基因構建到BD載體上，若其表達產生的BD單獨與UAS結合也可以引起下游報告基因的轉錄，那么就稱之為酵母雙雜中的自激活現象。反過來，可以利用這種自激活現象來驗證某個轉錄因子是否具有轉錄激活活性。第七頁，共十五頁，編輯于2023年，星期五His,β-gal自激活原理TranscriptionfactorsGAL4BD第八頁，共十五頁，編輯于2023年，星期五YPDA液體500ml固體100ml蛋白胨10g2g酵母提取物5g1g瓊脂——2g0.2%ade10ml2ml葡萄糖10g2gYPDA培養基0.2gade定容至100ml→0.2%的ade母液pH6.5滅菌121℃15min第九頁，共十五頁，編輯于2023年，星期五正對照：pGAL4負對照：pBD-GAL4第十頁，共十五頁，編輯于2023年，星期五將-70℃下凍存的酵母菌在YPAD平板上劃線，倒置于30℃培養2-3天。挑取2-4個大菌落（直徑2-3mm）于1.5mlYPAD液體培養基中，劇烈震蕩5min，打散菌落，接種于50mlYPAD液體培養基中（250ml三角瓶），230-250轉/min，30℃培養18-24hr。取菌液測定其OD600值，需達到1.5。若不到，再培養1~2hr，若還不到，換單克隆重搖。取50ml菌液于300mlYPAD培養基中（1-2L大三角瓶），30℃，230rpm，搖培3hr，至OD600值為0.4~0.6。4000rpm5min于常溫收集菌體，重復一次。室溫下1000g離心5min，去上清，加入50ml超純水清洗懸浮3次。1000g離心5min，棄上清，用新配的1.5ml1×TE/LiAc重懸細胞，置冰上，即成為酵母感受態細胞。（只能現做現用，不能貯存，室溫只能放置1-2hr）。酵母菌株感受態細胞制備：第十一頁，共十五頁，編輯于2023年，星期五

酵母轉化鮭魚精DNA（20μg/μl）沸水中煮20min，冰上冷卻10min。加入100μl酵母感受態細胞、1~2μl構建質粒（約200ng）、100μg鮭魚精、600μlTE-LiAc-PEG，變速渦旋10s~1min至混勻。30℃，200rpm/min，恒溫搖床振蕩30min。加入70μlDMSO，溫和顛倒混勻。42℃水浴熱休克15min，后冰浴10min。常溫下，3000rpm離心10s；棄上清（去干凈），用0.5ml1×TE重懸細胞。（1×TE室溫只能放置1~2hr）將轉化后的酵母培養于SD/-Trp培養基上，30℃倒置培養約3-5天，直至出現菌落。第十二頁，共十五頁，編輯于2023年，星期五陽性克隆的篩選：將在SD/-Trp培養基上長出的酵母菌落轉移到SD/-His培養基上進行篩選。30℃培養2天，檢查生長情況。對生長狀態較好的單克隆進行β-半乳糖苷酶活性分析。第十三頁，共十五頁，編輯于2023年，星期五β-半乳糖苷酶活性分析（酵母克隆濾紙顯色分析）取2ml的Z緩沖液/X-gal溶液潤透2張濾紙；小心取一張濾紙覆蓋于生長有轉化子的平皿上，用涂布棒小心趕出氣泡，使濾紙盡可能與酵母菌接觸（1min）；用一根針在濾紙上刺個小孔以標記菌落位置，用鑷子輕輕取出濾紙，沾有菌的面朝上置液氮中10s，夾出濾紙，室溫解凍；重復3次；沾有菌的面朝上，緊貼于預先用Z緩沖液/X-gal溶液潤透過的那張濾