辣根過(guò)氧化物酶臨床檢驗(yàn)試劑中的常用酶01簡(jiǎn)介制備目錄02基本信息辣根過(guò)氧化物酶（HorseradishPeroxidase,HRP），是臨床檢驗(yàn)試劑中的常用酶。該產(chǎn)品不但廣泛用于多個(gè)生化檢測(cè)項(xiàng)目，也廣泛運(yùn)用于免疫類（ELISA）試劑盒。過(guò)氧化物酶作為多個(gè)試劑盒顯色體系的關(guān)鍵成分，對(duì)試劑盒的質(zhì)量有重要影響。簡(jiǎn)介用途該酶催化簡(jiǎn)介該酶催化Donor+H2O2--→Oxidizeddonor+2H2O。辣根過(guò)氧化物酶（HorseradishPeroxidase,HRP）

比活性高，穩(wěn)定，分子量小，純酶容易制備，所以最常用。HRP廣泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由無(wú)色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結(jié)合而成的糖蛋白，糖含量18%。HRP由多個(gè)同工酶組成，分子量為40,000，等電點(diǎn)為pH3～9，酶催化的最適pH因供氫體不同而稍有差異，但多在pH5左右。酶溶于水和58%以下飽和度硫酸銨溶液。HRP的輔基和酶蛋白最大吸收光譜分別為403nm和275nm，一般以O(shè)D403nm/OD275nm的比值RZ（德文ReinheitZahl）表示酶的純度。高純度的酶RZ值應(yīng)在3.0左右（最高可達(dá)3.4）。RZ值越小，非酶蛋白就越多。用途（1）RZ＞3活性＞250u/mg，主要應(yīng)用于免疫學(xué)，是高純度的過(guò)氧化酶。采用特殊色譜純化技術(shù)以除去會(huì)影響免疫學(xué)反應(yīng)的同工酶B.（2）RZ＞2活性＞180u/mg，主要應(yīng)用于臨床化學(xué)，我們的客戶也有將這個(gè)規(guī)格的產(chǎn)品應(yīng)用于免疫學(xué)研究的。此時(shí)，一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化的分析方法就變得尤為重要。（3）RZ＞1活性＞100u/mg，主要應(yīng)用于血糖試紙和尿液分析試紙。（4）RZ＞0.6活性＞60u/mg，主要應(yīng)用于尿液分析試紙。制備實(shí)驗(yàn)原理操作步驟儀器和試劑制備實(shí)驗(yàn)原理過(guò)氧化物酶催化以下反應(yīng)：2H2O2→O2+2H2O這一類酶以鐵卟啉為輔基，所以屬血紅素蛋白質(zhì)類（hemeProteins）。過(guò)氧化物酶在生物界分布極廣，在細(xì)胞代謝的氧化還原過(guò)程中起重要的作用。本實(shí)驗(yàn)是以辣根為原料，經(jīng)過(guò)水的抽提，硫酸銨和丙酮分級(jí)分離，再經(jīng)鋅離子純化，透析除鹽，冷凍干燥，最后制得高純度的辣根過(guò)氧化物酶。辣根過(guò)氧化物酶分子量在40,000左右，是一種含亞鐵血紅素的蛋白質(zhì)，等電點(diǎn)7.2；易溶于水，溶解度為5%（W/V），溶液呈棕紅色，透明；也溶于0.58飽和度以下的硫酸銨溶液，而0.62飽和度以上則不溶。該酶最適pH為7.0（對(duì)愈創(chuàng)木酚為氫給體而言）。在室溫下HRP在幾周內(nèi)保持穩(wěn)定，加熱到63℃后15分鐘內(nèi)穩(wěn)定。辣根過(guò)氧化物酶氧化還原電勢(shì)很低，pH6.08時(shí)，E’0=-0.2070V；pH為7.71時(shí)，E’0=-0.5787V。儀器和試劑儀器離心機(jī)、干燥器、分光光度計(jì)。試劑⒈硫酸銨：工業(yè)純和化學(xué)純；⒉丙酮。⒊10mMpH7.0磷酸鹽緩沖液：稱取243.5毫克磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）和857毫克磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O），溶于400毫升水中。⒋20mM愈創(chuàng)木酚溶液：取0.22毫升愈創(chuàng)木酚加水至100毫升。⒌40mM過(guò)氧化氫溶液：取0.4毫升30%過(guò)氧化氫加水至100毫升（如測(cè)k1則用10mM過(guò)氧化氫溶液）。臨用前配制。⒍5%乙酸鋇溶液⒎奈氏試劑操作步驟（一）HRP的制備⒈水提取：稱取10斤用水沖刷干凈的鮮辣根（辣根皮中亦含有豐富的HRP），用菜刀切成小碎塊，在攪肉機(jī)中攪碎1~2次。碎渣漿用1倍體積的水在低溫下攪拌提取過(guò)夜（亦可采用高速抽提法）。次日用甩干機(jī)（或離心機(jī)）甩干，收集濾液，碎渣再用1/4倍體積水浸泡提取一次，合并兩次濾液，量總體積和度，0。⒉硫酸銨分級(jí)分離：在不斷攪拌下，每升濾液中慢慢加入226克硫酸銨粉末（相當(dāng)于0.40飽和度），大約在1~2小時(shí)內(nèi)加完，置冷室中放置過(guò)夜。次日將上清液小心地用虹吸管移出，下面渾濁液以3000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，棄沉淀，合并上清液。再按每升上清液加258克硫酸銨粉末（0.8飽和度）隨加隨攪拌，當(dāng)硫酸銨全部溶解后，置冷室過(guò)夜。次日，虹吸出上清液，沉淀部分在冰凍離心機(jī)中以轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，棄去上清液，收集沉淀。將沉淀懸浮于100~150毫升蒸餾水中（加水量要使沉淀全部溶解為止），分裝于透析袋內(nèi)，放在流動(dòng)自來(lái)水中進(jìn)行透析1~2天，直到硫酸銨透析完畢為止（可用5%乙酸鋇溶液或奈氏試劑進(jìn)行檢查）。然