人子宮蛻膜樹突狀細胞DEC【摘要】目的：探討人子宮蛻膜樹突狀細胞的分離方法和誘導培養的最佳條件，為研究樹突狀細胞在母胎免疫耐受中的作用奠定基礎。方法：人早孕子宮蛻膜組織經機械破碎，梯度離心獲得蛻膜低密度細胞，經粒-巨噬細胞集落刺激因子和干細胞因子誘導，所獲得細胞用FITC標記的抗人DEC-205、HLA-DR、CDllc抗體進行鑒定。結果：從蛻膜組織可獲取足夠數量蛻膜樹突狀細胞，體外培養10~18d細胞生長較為活躍，第14天左右達到最高值，維持3~4d開始下降，20d內細胞數仍能維持在×105個/mL。結論：梯度離心法能成功分離蛻膜樹突狀前體細胞，GM-CSF和SCF體外誘導可提供蛻膜樹突狀細胞原代培養較為滿意的生長條件。

【關鍵詞】妊娠；免疫耐受；蛻膜；樹突狀細胞；分離和純化

〔Abstract〕ObjectiveToinvestigatetheseparationmethodsandgrowthconditionsofdecidualdendriticcells,andestablishthegroundworkfortheresearchofdendriticcell‘sfunctionarymechanisminmaternalimmunityandtolerancetothefetus.MethodsThefreshearlygestation(7~12wkgestation)decidualtissuewasdispersedmechanicallyinHank‘Sbalancedsaltsolution,andthelowdensitycellswereobtainedgradientcentrifugationandculturedwithgranulocytemacrophagecolony-stimulatingfactor(GM-CSF)andstemcellfactor(SCF).Thenthegeneratedcellswereidentifiedphenotypicandfunctionalmethods.ResultsAtotalof~×105decidualdendriticcellswereobtainedfromthefreshdecidualtissue.Thesecellsgrewvigorouslywithin10~18daysandreachedthepeakatthe14thday.ConclusionThemethodofechanically,gradientcentrifugationcansuccessfullyseparatethedecidualdendriticcells.GM-CSFandSCFcanpromotethegrowthofthedecidualdendriticcellsandprovidesatisfactorygrowthconditionsforthem.

〔KeyWords〕Gestation;Immunityandtolerance;Deciduas;Dendriticcells;Separationandpurification

正常妊娠有賴于母體和胎兒間的免疫平衡。正常妊娠時，母體免疫系統以Th2型免疫應答為主，保護胚胎乃至胎兒胎盤不被母體排斥，維持母體對胎兒的免疫耐受。研究表明[1]，樹突細胞對母體免疫耐受的啟動起著重要作用，發現早孕期蛻膜中存在HLA-DR+lin-的樹突細胞，并認DEC-205+可作為蛻膜樹突狀細胞的標志。本研究采用密度梯度離心法成功分離了人早孕子宮蛻膜樹突狀細胞，并用粒－巨噬細胞集落刺激因子和干細胞因子誘導其大量生長，為后續研究樹突狀細胞在母胎免疫耐受中的作用奠定了基礎。

1材料和方法

材料

人早孕子宮蛻膜組織。D-Hanks‘，配制方法見文獻，高壓滅菌備用；細胞分離液：3%Ficoll/10%泛影葡銨；RPMI1640，使用前加入青霉素、鏈霉素、10%小牛血清；50g/LGM-CSF；20g/L干細胞因子。抗人DEC-205、HLA-DR和CD11c。

方法

蛻膜樹突狀細胞分離和培養無菌切除的新鮮蛻膜組織用D-Hanks‘液沖洗2次，置入消毒后的組織勻漿器中，加入D-Hanks‘l0mL制成勻漿，200目金屬網過濾，20℃、100×g離心60s，棄上清，小心地將蛻膜細胞懸液加入含10mL細胞分離液的離心管液面上，20℃、200×g離心20min。收集上層低密度細胞。調節細胞密度為5×105個/mL，取2mL加入6孔培養板，補加RPMI-1640培養液2mL，37℃，5％CO2培養箱中進行培養，間隔3~4d半量更換細胞培養液。實驗分對照組、50g/LGM-CSF組、20g/LSCF組和50g/LGM-CSF+20g/LSCF組，加入相應濃度的刺激因素。

細胞觀察及鑒定每24h行細胞計數，制作生長曲線，倒置顯微鏡觀察細胞形態及細胞生長情況。用蛻膜樹突狀細胞特異性標記物抗人DEC-205-FITC、HLA-DR-FITC和CD11c-FITC抗體通過免疫熒光染色方法來鑒定上述培養細胞，觀察其表達情況。

2結果

蛻膜細胞制備和分離

采用機械破碎，金屬網過濾，梯度離心法，能獲取足夠的蛻膜樹突狀前體細胞，數量達~×107，滿足蛻膜樹突狀細胞原代細胞培養的需要。

細胞生長曲線

見圖1。蛻膜細胞接種后，數量均有一明顯下降，第5天達最低值，可能是細胞懸液中蛻膜細胞死亡所致。體外培養10~18d蛻膜樹突狀細胞生長較為活躍，第14天左右細胞數達到最高峰值，維持3~4d后開始下降，但20d內細胞數仍可維持較高水平。在細胞培養液中加入GM-CSF、SCF誘導后與對照組比較，蛻膜樹突狀細胞數量均有不同程度增加；其中二者合用誘導后蛻膜樹突狀細胞數量增加最為明顯；三者在培養10~18d均能獲得足夠數量蛻膜樹突狀細胞。

蛻膜樹突狀細胞的形態和生長變化

倒置顯微鏡觀察蛻膜樹突狀細胞體外培養最初呈圓形或卵圓形，7~9d后出現典型分裂相，胞質內可見二倍體核型；10~11d細胞分裂旺盛，相互聚集有貼壁現象；14d左右細胞貼壁，胞膜向外延伸出尖狀突起，胞質中見圓形或卵圓形細胞核，細胞生長呈簇狀聚集，此狀態可持續到第18天左右。此后細胞分裂逐漸減慢，活細胞開始離解和死亡，至第21天左右細胞明顯減少，第28天細胞完全死亡。形態學觀察表明：原代培養的蛻膜樹突狀細胞在10~18d生長和分裂能力很強，此后逐漸衰退，最長可達28d。

蛻膜樹突狀細胞鑒定

免疫熒光觀察顯示為陽性反應，即所培養的細胞是蛻膜樹突狀細胞DEC-205+HLA-DR+CD11c+。

3討論

妊娠以后母體免疫系統發生若干變化，如Th1/Th2系統向Th2偏移，NK細胞毒性下降CD4+CD25+調節性T細胞增多等，母胎界面也形成了免疫耐受的微環境。可見母胎免疫耐受不是被動的不識別胚胎抗原，而是一個主動識別和耐受的過程。而母體對胚胎抗原的識別必然離不開抗原遞呈細胞—樹突細胞。因此，樹突細胞對母體免疫耐受的啟動起著重要作用。Gardner等[1]對人蛻膜中樹突細胞的表型和分布進行了研究，發現在早孕期蛻膜中存在HLA-DR+lin-的樹突細胞，并且為未成熟型，主要特點為HLA-DR+CD11c+DEC-205+CD40+DC-sign-CD1α-CD123-，并認為DEC-205+可作為蛻膜樹突細胞的標志。免疫組化顯示DEC-205+的樹突樣細胞散在分布于蛻膜中，在種植部位可見其與滋養細胞很接近。Blois等對孕鼠子宮局部及外周血中的樹突細胞在孕期的變化進行研究發現：①CD11c+樹突細胞在孕d開始上升，d達高峰，~d為平臺期。②在子宮局部只有30%的樹突細胞表達MHCⅡ類分子，表明大部分的樹突細胞處于非成熟狀態，并且在孕~d，MHCⅡ類分子的表達明顯下降，其表型也轉為分泌Th2型細胞因子的CD8α-樹突細胞，提示樹突細胞可能在胚胎抗原的耐受中起重要作用，但是目前尚缺乏直接證據。關于樹突細胞在母胎免疫耐受中的作用還有很多未知。

要研究樹突狀細胞在母胎免疫耐受中的作用，需要進行樹突狀細胞的原代培養。而要將蛻膜樹突狀前體細胞從中分離出來較為困難。國外文獻報道組織樹突細胞的分離方法主要有兩種：體外組織培養和流式細胞儀分選[6，7]。前者分離純度低，后者程序復雜且消耗大量抗體，均不能快速簡便地獲取樹突細胞。本研究采用的方法簡便、高效、重復性好，能夠滿足蛻膜樹突狀細胞原代培養的需要，是一種較為成功的蛻膜細胞分離方法。我們還對蛻膜樹突狀細胞體外培養最佳條件進行了探討。在RPMI-1640培養液中，蛻膜樹突狀細胞生長緩慢，加入GM-CSF和SCF誘導后，可促使蛻膜樹突狀前體細胞向成熟蛻膜樹突狀細胞轉化，細胞生長活躍，對數生長期提前并延長，細胞數量較對照組大幅度增加，在培養第10~18天均能達到~×105，滿足后續實驗的需求，便于相關課題研究的深入開展。

【參考文獻】

〔1〕GardnerL,MoffettA.Dendriticcellsinthehumandeciduas〔J〕.Biologyofreproduction,2003,69:1438-1446

〔2〕蔡文琴,王伯云.實用免疫細胞化學與核酸分子雜交技術〔M〕.成都:四川省科技出版社,1994.496

〔3〕HillME,FergusonDJ,AustynJM,eta1.Potentimmunostimulatorydendriticcellscanbeculturedinbulkfromprogenitorsinnol‘l12alinfantandadultmyasthenichumanthymus〔J〕.Immunology,1999,97:325-332

〔4〕AluvihareVR,KallikourdisM,BetzAG.RegulatoryTcellsmediatematernaltolerancetothefetus〔J〕.Natureimmunology,2004,5(3):266

〔5〕BloisSM,AlbaSotoCD,TomettenM,etal.Lineage,maturity,andphenotypeofuterinemurinedendriccellsthrouthgestationindicateaprotectiveroleinmaintainingpregnancy〔J〕.Biologyofreproduction,2004,70:1018-1023

〔6〕VremecD,ZorbasM,ScolayR.Thesurfacephenotypeofdendriticcellspurifiedfrommouset