PAGEPAGE3氨基甲酸酯類(carbamate)酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒使用說明書本試劑盒僅供研究使用。1使用目的：本試劑盒用于蔬菜、水果、相應(yīng)食物、水及中毒殘留物中氨基甲酸酯類(carbamate)殘留的定量檢測。2實(shí)驗(yàn)原理本試劑盒采用競爭ELISA方法，在微孔板包被有氨基甲酸酯類(carbamate)偶聯(lián)抗原，加入氨基甲酸酯類(carbamate)標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，游離氨基甲酸酯類(carbamate)與微孔條上預(yù)包被的氨基甲酸酯類(carbamate)偶聯(lián)抗原互相競爭抗氨基甲酸酯類(carbamate)抗體酶標(biāo)記物，用TMB底物顯色，加入終止液后顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色，用酶標(biāo)儀在450nm波長下進(jìn)行檢測，吸光值與樣品中氨基甲酸酯類(carbamate)含量成反比，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中氨基甲酸酯類(carbamate)的含量。3試劑盒組成3.1預(yù)包被的氨基甲酸酯類(carbamate)偶聯(lián)抗原的可拆酶標(biāo)板：1塊（12孔×8條）。

3.2氨基甲酸酯類(carbamate)標(biāo)準(zhǔn)品：6瓶（1ml/瓶），含量分別是：0ppb，0.1ppb,0.3ppb,0.9ppb,2.7ppb,8.1ppb。

3.3抗氨基甲酸酯類(carbamate)抗體酶結(jié)合物：1瓶（6ml）。

3.4顯色液A：1瓶（6ml）。

3.5顯色液B：1瓶（6ml）。

3.6終止液：1瓶（6ml），2M硫酸。

3.7樣本稀釋液：1瓶（10×,6ml），用于樣品稀釋用。

3.8濃縮洗滌液：1瓶（20×，20ml），用于洗板。

3.9說明書一份。4需要而未提供的材料

4.1設(shè)備

4.1.1波長450nm酶標(biāo)儀。

4.1.2粉碎機(jī)。

4.1.3量筒。

4.1.4振蕩器。

4.1.5漏斗。

4.1.6WhatmanNo1或相當(dāng)?shù)臑V紙。

4.1.7微量移液器。

4.2試劑

4.2.1去離子水或蒸餾水。

4.2.2甲醇。

5貯存

5.1試劑盒貯存于2~8℃，切勿冷凍

5.2未用完的微孔板應(yīng)該密封干燥保存

6注意事項(xiàng)

6.1使用試劑盒前請仔細(xì)閱讀說明書。

6.2不要使用過期試劑盒。

6.3試劑盒使用前，將試劑恢復(fù)至室溫（25±2℃），建議至少回溫2小時。

6.4標(biāo)準(zhǔn)品中含有氨基甲酸酯類(carbamate)，使用時應(yīng)特別注意，操作時應(yīng)帶手套。

6.5終止液中含有硫酸，使用時防止灼傷皮膚及腐蝕衣物。

6.6不同標(biāo)準(zhǔn)品、樣品所用吸頭不能混用，否則會影響試驗(yàn)結(jié)果。

6.7不同批號試劑盒中的試劑不得混用；不同標(biāo)準(zhǔn)品、樣品所用吸頭不得混用，否則會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

6.8稀釋樣本時必須用本試劑盒中的樣本稀釋液，否則會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果

6.9混合試劑時應(yīng)避免起泡。

7工作液準(zhǔn)備

7.1氨基甲酸酯類(carbamate)標(biāo)準(zhǔn)品溶液：0ppb,0.1ppb,0.3ppb,0.9ppb,2.7ppb,8.1ppb

7.2濃縮洗滌液：用蒸餾水按1:20(1+19)稀釋備用7.3樣本稀釋液：用蒸餾水按1:10(1+9)稀釋備用

7.3顯色劑：已備用，避免光線直照

7.4反應(yīng)終止液：已備用

8樣品處理程序（樣品在提取過程中，要嚴(yán)格按說明書操作，提取過程中應(yīng)準(zhǔn)確稀釋，否則會出現(xiàn)結(jié)果不準(zhǔn)確，樣品應(yīng)當(dāng)保存在陰涼避光之處及冷藏保存）

8.1取10g粉碎的樣品，加20ml70%甲醇溶液

8.2強(qiáng)力振蕩3分鐘

8.3用WhatmanNo1濾紙過濾

8.4取25μl處理后的樣品，加入25μl樣本稀釋液于反應(yīng)孔中（樣本稀釋倍數(shù)為2）

9酶免分析步驟

9.1實(shí)驗(yàn)須知

9.1.1實(shí)驗(yàn)開始前請將所有試劑于盒外充分恢復(fù)至室溫（25±2℃），時間約2小時。回溫至室溫（25±2℃）后再取出微孔條，多余的微孔條重新密封立即于2~8℃干燥保存

注：一定保證回溫充分，否則影響檢測的精確度和準(zhǔn)確度。

9.1.2使用后請立即將試劑放回2~8℃保存

9.1.3請不要改變分析程序

9.1.4請使用精確的微量移液器

9.1.5操作一旦開始，請不要中斷任何程序

9.1.6ELISA結(jié)果的可重復(fù)性極大程度的取決于操作程序，請嚴(yán)格按照要求操作

9.1.7為避免交叉污染，每個標(biāo)準(zhǔn)品和樣品均應(yīng)使用不同的吸頭加樣

9.1.8加樣時請勿讓吸頭接觸微孔中的溶液或內(nèi)表面

9.2分析步驟

9.2.1預(yù)先進(jìn)行編號，標(biāo)記B0、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置，推薦進(jìn)行雙孔檢測

9.2.2取所需數(shù)量的微孔（微孔條可拆），將多余板條重新密封并立即放回2~8℃保存

9.2.3樣品稀釋液（10×）、濃縮洗滌液（20×）稀釋成工作液(蒸餾水或去離子水稀釋)

9.2.4在B0孔中加入50μL0ppb標(biāo)準(zhǔn)品溶液

9.2.5在各標(biāo)準(zhǔn)孔中加入50μl的標(biāo)準(zhǔn)品溶液

9.2.6在各樣品孔中加入50μl樣品溶液

9.2.7在所有孔中加入50μl的抗氨基甲酸酯類(carbamate)抗體酶結(jié)合物

9.2.8輕輕晃動反應(yīng)板幾秒鐘。

9.337℃溫浴30min（溫浴過程中不時輕拍反應(yīng)板，可以減少雙孔誤差）

9.3.1甩掉孔中液體，用洗液洗滌微孔板5次，最后一次應(yīng)在吸水紙上拍打以完全除去孔中液體。

9.4反應(yīng)

9.4.1洗滌程序完成后，立即用微量移液器在每個微孔中先加入50μl顯色液A，再加50μl顯色液B；輕微晃動反應(yīng)板使之徹底混勻

9.4.237℃溫浴10min

9.4.3每孔中加入50μl終止液，混勻

9.4.4在450nm下檢測吸光度，結(jié)果在5min內(nèi)讀取。

10結(jié)果計(jì)算

10.1定量分析

10.1.1所獲得的每個濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以第一個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

10.1.2以氨基甲酸酯類(carbamate)濃度的對數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。根據(jù)樣品百分吸光度值，可從曲線上得到對應(yīng)點(diǎn)的橫坐標(biāo)，即為氨基甲酸酯類(carbamate)濃度的對數(shù)值，求得反對數(shù)即為測定液中氨基甲酸酯類(carbamate)濃度C（ppb）

10.1.3由于樣品經(jīng)過了預(yù)先稀釋，因此根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得出的樣品濃度一定要再乘以其稀釋倍數(shù)。

10.2半定量測定

10.1.1目測半定量測定：首先選擇一個適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)液與樣品同運(yùn)行，根據(jù)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品顏色深淺比較，判斷樣品濃度值是小于還是大于標(biāo)準(zhǔn)值。

10.1.2儀器半定量測定：首先選擇一個適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)液與樣品同運(yùn)行，根據(jù)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值的高低比較，判斷樣品濃度值是小于還是大于標(biāo)準(zhǔn)值。

11特異性

物質(zhì)交叉反應(yīng)

氨基甲酸酯類(carbamate)100%

12試劑盒參數(shù)

本試劑盒檢測下限為0.0