基因表達沉默技術1第一頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日教學內容及要求1234反義核酸技術核酶技術基因敲除技術RNA干擾技術重點熟悉2第二頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日參考資料《基因工程及其分子生物學基礎-基因工程分冊》，北京大學出版社，靜國忠編自備材料（個人實踐經驗）3第三頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日第一節RNA干擾技術4第四頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日基本概念掌握RNA干擾(RNAinterference,RNAi):由小雙鏈RNA誘發的、同源mRNA高效特異性降解的現象。小干擾RNA:具有干擾功能的這種短雙鏈RNA就稱為小干擾RNA（SmallinterferingRNA,siRNA)。5第五頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日注射sense秀麗線蟲antisense注射1995年．．．．．．發現歷史6第六頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日反義RNA(antisenseRNA)對基因抑制效應比較微弱；而雙鏈RNA（dsRNA）能夠高效特異性阻斷靶基因的表達。

animportantfinding！．．．．．．1998年7第七頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日

CraigC.Mello

克雷格·梅洛AndrewZ.Fire安德魯·菲爾2006NobelPrizeinPhysiologyorMedicine8第八頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日隨后陸續發現RNAi也存在于水稻、煙草、果蠅、小鼠及人等幾乎所有的真核生物中。RNAi現象的普遍性9第九頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日靶RNAi機制siRNA在ATP參與下形成RISC復合體，被RNA解旋酶解旋成單鏈，并由其中的反義鏈指導移至靶mRNA，靶mRNA被切割后誘發宿主細胞針對這些mRNA的降解反應。外源長dsRNA在ATP作用下被RNaseⅢDicer切割成21nt左右、由正義和反義鏈組成的siRNA重點10第十頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日siRNA19bpduplex2nt3’overhangs21ntsiRNA實驗設計難點11第十一頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日1）靶序列的調出NationalCenterfor

BiotechnologyInformation

12第十二頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日13第十三頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日14第十四頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日2）利用免費設計軟件進行siRNA設計InvitrogenTakaraOligoegine

15第十五頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日軟件的選擇原則1、選擇可讀框內、翻譯起始位點之后50～100nt的序列作為靶序列；2、選擇的靶位5’端之前的兩個堿基為AA；3、GC含量控制在35%～65%,最好50%左右；4、堿基數目控制在19～21nt；5、避免連續3個或3個以上的相同堿基；6、避免重復序列或回文結構以免形成發夾狀結構；7、靶序列同數據庫進行BLAST同源性比對。16第十六頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日我用的軟件：siDirect17第十七頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日3）siRNA合成或表達RNA聚合酶Ⅲ啟動子（包括U6或H1）：轉錄起始點明確；轉錄生成小RNA；轉錄產物無polyA尾；轉錄終止為5個連續的U。18第十八頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日19第十九頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日20第二十頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日21第二十一頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日3mg/ml正向引物1μl3mg/ml反向引物1μl90°C4min70°C10min室溫訂購合成的引物序列退火22第二十二頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日4)siRNAworking?23第二十三頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日mRNA:Real-timePCRProtein:Westernblot17siRNAMock24第二十四頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日5)合成or構建載體？化學合成siRNA：

瞬時轉染實驗花費高使用的時候，要用二乙基焦碳酸酯（DEPC）處理過的滅菌蒸餾水溶解，這是因為siRNA易被RNA酶降解。B.載體：為了長期觀察基因沉默后的影響，需要長期表達siRNA。C.載體選擇：易轉染的細胞用質粒載體，難轉染的細胞用逆轉錄載體或慢病毒載體。25第二十五頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日6）體外導入細胞a.脂質體轉染：＋＋＋＋＋－－－－－－＋具體操作步驟：按照脂質體說明書進行26第二十六頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日b.電穿孔導入：27第二十七頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日c.病毒感染（以腺病毒為例）：28第二十八頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日next29第二十九頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日第二節反義核酸技術30第三十頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日1978年，Stephenson和Zamecnik首次報道了反義寡脫氧核苷酸可抑制勞斯肉瘤病毒RSV的復制現象。1984年，Izantweintraub提出了“反義核酸技術”的概念。InhibitionofRoussarcomaviralRNAtranslationbyaspecificoligodeoxyribonucleotide.ProcNatlAcadSciUSA,1978;75:285-288.歷史由來31第三十一頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日反義寡核苷酸概念：正義鏈互補的一段核苷酸序列，包括反義DNA和反義RNA?；靖拍罘戳xRNA技術反義DNA技術32第三十二頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日反義抑制的主要機理直接作用于靶mRNA的SD序列或部分編碼區，直接抑制翻譯，或與靶mRNA結合形成雙鏈RNA，從而易被RNA酶H降解。反義核酸mRNARNaseH33第三十三頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日論著超過１６０００篇?；蚬δ苎芯浚?994年流行）

如抗病毒或抗腫瘤基因治療研究等領域。反義核酸應用34第三十四頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日1998年8月27日，美國食品藥品管理局（FDA）正式批準了由ISIS公司開發的全球第一個反義藥物“Vitravene”（福米韋生，fomivirsen）在美國上市。該藥抗病毒作用較強，是更昔洛韋的1000倍，用于治療巨細胞病毒性視網膜炎和艾滋病人并發巨細胞視網膜炎,有效率高達80%-90%。Vitravene為注射劑，患者每月只需注射一次藥物（利用專用針頭直接注射進眼球內），不良反應有虹膜炎、玻璃體炎，發生率為25％，用糖皮質激素治療可緩解或消除其炎性反應。2１個硫代磷酸酯寡聚脫氧核苷酸組成５＇－ＧＣＧＴＴＴＧＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＣＧ－３＇

35第三十五頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日a.避免內源性核酸酶對其降解b.提高自身穩定性以及與靶分子的親和力Hdeoxyribose提高有效性技術難點修飾36第三十六頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日第一代硫代修飾（Phosphorothioate）ResistingToNucleases；ActivatingRNaseHpathwaysO37第三十七頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日第二代修飾(2’-O-methyl,2’-O-methoxyethyl)ResistingToNucleases；notactivatingRNaseHpathways38第三十八頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日2001主要用于治療老年人中十分常見的視網膜黃斑退化癥

Macugen哌加他尼39第三十九頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日

2003新一代抗HIV新藥，屬于病毒的融合阻止劑類藥物

Fuzeon

20570$40第四十頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日Tysabri2004專治多發性硬化癥

41第四十一頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日next42第四十二頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日第三節核酶技術43第四十三頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日核酶（ribozyme）ribonucleicacidenzyme具有催化活性的RNA，化學本質是RNA,卻具有酶的催化功能。基本概念44第四十四頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日切赫(T.R.Cech)（1947-），美國人,他獨立地發現發現四膜蟲轉錄產物rRNA前體，可切除自身的413個核苷酸的內含子，使兩個外顯子拼接起來，變成成熟的rRNA分子。歷史由來ThomasR.Cech1982

45第四十五頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日S.Altman研究發現發現大腸桿菌RNaseP的蛋白質部分除去后，留下RNA能夠切割rRNA前體的5’端。1983

46第四十六頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日1989NobelPrizeinChemistry核酶的發現改變了“所有酶都是蛋白質”的傳統觀念47第四十七頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日

有封閉切割RNA應用——阻斷基因的表達（1994年左右比較流行的研究工具）48第四十八頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日通常由60個核苷酸左右組成；底物部分：含有GU序列；保守序列：13個堿基。錘頭狀核酶結構示意圖49第四十九頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日next50第五十頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日第四節基因敲除技術時間：80年代末功能：建立基因失活或缺失的動物模型51第五十一頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日發展歷史a.胚胎干細胞（embryonicstemcell，ES）分離培養取自小鼠受精卵發育第4，5天的胚胎細胞能在體外培養，保留發育的全能性

1981年，馬丁·埃文斯(MartinJ．Evans)從正常的小鼠囊胚中分離到了ES細胞。小鼠ES細胞的分離和應用是ES細胞技術發展的里程碑。52第五十二頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日同源重組：是指發生在減數分裂或者有絲分裂過程中相同或者相似DNA序列間的重組，通常通過一對同源分子非姊妹染色體間的斷裂而產生新的重組片段。b.同源重組技術應用53第五十三頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日1985年，奧利弗·史密塞斯(OliverSmithies)等首次報道在腫瘤細胞中實現了人工打靶載體和內源β-球蛋白基因間的同源重組。54第五十四頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日1988年，卡佩基安德等發展了一種稱為“正負篩選”的策略，將胸腺嘧啶激酶基因（tk）置于打靶載體的外側，作為篩選的負性標記。這比單用陽性篩選正確克隆富集的倍數高3~10倍，真正使得同源重組技術得以應用。馬里奧·卡佩基安德(MarioR．Capechiand)丙氧鳥苷55第五十五頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日MartinEvans馬丁·埃文斯MarioCapecchi馬里奧·卡佩基OliverSmithies奧利弗·史密斯56第五十六頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日原理和