第17講

微生物的利用與酶的應用專題八生物技術實踐1.大腸桿菌的培養和分離。2.分離以尿素為氮源的微生物。3.果汁中的果膠和果膠酶。4.α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的檢測。考綱要求內容索引梳理核心要點排查易混易錯熱點考向探究01梳理核心要點SHULIHEXINYAODIAN1.培養基與微生物培養LB液體LB固體提醒

(1)LB固體培養基添加瓊脂等凝固劑，用于單菌落的分離。(2)全營養LB培養基與尿素固體培養基：①全營養LB培養基(含瓊脂糖)是基礎培養基；②尿素固體培養基：選擇培養基(如以尿素作為唯一氮源的尿素培養基)和鑒別培養基(如尿素培養基中加入酚紅)。(3)加入尿素前的固體培養基用高壓蒸汽滅菌法滅菌，尿素溶液用G6玻璃砂漏斗過濾。2.滅菌與消毒的比較類型適用范圍操作方法及注意點消毒方法煮沸消毒法日常生活100℃煮沸5～6min巴氏消毒法不耐高溫的液體70～75℃煮30min或80℃煮15min化學藥劑水源或生物體結構部分等擦拭，如用

擦拭雙手；成熟紫葡萄用高錳酸鉀浸泡5min；外植體在70%酒精中浸泡10min，再放入5%次氯酸鈉溶液中浸泡5min，然后用另一5%次氯酸鈉溶液浸泡5min紫外線房間、儀器設備紫外線照射30min熱水泡菜壇等熱水清洗壇內壁兩次70%酒精滅菌方法灼燒接種環、接種時用的試管口或瓶口等直接在酒精燈火焰的外焰燒紅接種環或試管口和瓶口過火高壓蒸汽滅菌生產和實驗室常用器具，如培養基、培養皿等高壓蒸汽滅菌鍋內，條件一般為1kg/cm2，溫度

℃，

min(若為葡萄糖，則滅菌條件為500g/cm2壓力，溫度90℃以上，30min)；滅菌時間從高壓鍋內有壓力后開始；高壓鍋或滅菌鍋壓力和大氣壓相同時才能打開鍋蓋過濾滅菌

等加熱會分解的物質G6玻璃砂漏斗過濾。G6玻璃砂漏斗使用前用

包好進行

；G6玻璃砂漏斗使用后用__________

浸泡，抽濾去酸，再用蒸餾水洗至洗出液呈中性，干燥后保存12115高壓蒸汽滅菌紙1mol/L鹽酸尿素其他操作空間：專門的接種室；操作設備：超凈臺(用前打開紫外燈和過濾風，用時關閉紫外燈，臺面用70%酒精擦拭)；操作環境：酒精燈火焰旁3.微生物分離的兩種常用方法的比較項目劃線分離法涂布分離法操作原理

劃線。由于劃線后，線條末端細菌的數目比線條起始處要

，每次從上一次劃線的

開始，能使細菌的數目隨著劃線次數的增加而

，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落將菌液進行一系列的

，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到

培養基的表面，進行培養。在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物將被分散成

細胞，從而能在培養皿表面形成單個菌落操作工具接種環_________連續少末端逐漸減少梯度稀釋固體單個玻璃刮刀使用要求用時需_____放置在70%酒精中，用時需灼燒分離特點操作簡單，不易分離獲得單菌落操作復雜，易分離獲得單菌落分離結果(圖示)

相同點使聚集在一起的微生物分散成單個細胞，從而能在培養基表面形成單個的菌落，以便于純化菌種灼燒提醒

劃線分離操作的注意事項(1)每次劃線之前及最后一次劃線之后都需要灼燒接種環。(2)灼燒接種環，待其冷卻后才能伸入菌液，以免溫度太高殺死菌種。(3)劃線時最后一區域不要與第一區域相連。(4)劃線用力大小要適當，防止用力過大將培養基劃破。4.大腸桿菌的培養與分離操作(1)原理①接種在

培養基中使其快速分裂增殖。②將待檢測微生物樣品通過劃線分離法或涂布分離法接種在

培養基上，樣品中的每一個細胞都可以生長繁殖形成

。LB液體LB固體單個菌落(2)流程液體固體37℃斜面5.分離以尿素為氮源的微生物(1)實驗原理①篩選以尿素為氮源的微生物，使用以

為唯一氮源的選擇培養基進行培養。②有些細菌合成的

能通過降解尿素作為其生長的氮源。③細菌合成脲酶能將尿素分解成

，使培養基的堿性增強，pH升高，從而使加入酚紅指示劑的培養基

。尿素脲酶氨變紅(2)操作步驟尿素菌落形態數目全營養涂布分離法提醒

分離以尿素為氮源的微生物中的易錯點(1)誤以為分離以尿素為氮源的微生物時，配制的培養基中加入酚紅作為酸堿指示劑，加入瓊脂作為凝固劑。應加入瓊脂糖作為凝固劑。(2)誤以為降解尿素的反應中反應物只有尿素。降解尿素的反應中反應物除了尿素外還有水。(3)誤以為尿素滅菌采用高壓蒸汽滅菌法。尿素遇高溫會分解，所以其滅菌方法為G6玻璃砂漏斗過濾除菌。6.探究酶活性最適條件和用量的實驗設計(1)探究影響果膠酶活性因素實驗的分析①實驗原則：遵循單一變量原則、對照原則，嚴格控制變量，盡量減少

的影響。②實驗原理：果膠酶活性受溫度、pH或酶抑制劑的影響，在最適溫度或pH時，其活性最高，果肉的出汁率、果汁的澄清度都與果膠酶的

呈正相關。無關變量活性大小(2)三個實驗的變量分析實驗名稱(目的)自變量因變量注意事項探究溫度對果膠酶活性的影響溫度果汁量(澄清度)①底物和酶在混合時的

是相同的；②溫度梯度越小，實驗結果越精確；③蘋果泥和果膠酶的用量在各個試管中應

；④pH應為最適pH溫度相同探究pH對果膠酶活性的影響pH果汁量(澄清度)①溫度應為

溫度；②pH梯度可用NaOH和HCl溶液調節；③用玻璃棒攪拌使反應充分進行探究果膠酶的用量_____________果汁量(澄清度)①制備蘋果勻漿后迅速加熱，使蘋果勻漿中的果膠酶變性；②溫度、pH應為最適且保持不變果膠酶的用量最適提醒

關于果膠的兩點說明(1)果膠的作用：粘合細胞。(2)果膠的鑒別方法：果膠不溶于乙醇，滴加95%的乙醇出現沉淀。7.固定化酶的制作原理、方法及作用(1)固定化酶的制作原理、方法吸附包埋重復利用(2)α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的檢測未吸附的酶底物02排查易混易錯PAICHAYIHUNYICUO1.微生物利用的正誤判斷(1)從有機廢水中分離能分解有機物的微生物時，接種后的培養皿需要放在光照培養箱中培養(

)提示異養微生物不需要光照。(2)消毒的原則是既殺死材料表面的微生物，又減少消毒劑對細胞的傷害(

)(3)每一次劃線后都要將接種環灼燒(

)(4)除第一次劃線外，每一次劃線的起點都是第一次劃線的末端(

)提示除第一次劃線外，每一次劃線的起點都是上一次劃線的末端。(5)篩選能分解尿素的細菌所利用的培養基中，尿素是唯一的氮源(

)×√√×√(6)可分解尿素的細菌在分解尿素時，可以將尿素轉化為氨，使得培養基的酸堿度降低(

)提示氨使培養基的酸堿度升高。(7)劃線分離操作簡便，但涂布分離更容易得到單菌落(

)(8)高壓蒸汽滅菌法是進行各種無菌操作都需要進行的滅菌方法(

)(9)利用LB液體培養基和LB固體培養基分別對微生物進行分離培養和擴大培養(

)(10)進入無菌室，首先打開超凈臺上的紫外燈和過濾風，然后在酒精燈的火焰旁制備固體平面培養基(

)×√×××2.酶應用的正誤判斷(1)將果膠酶用于果汁生產，既能提高果肉的出汁率又能提高果汁的澄清度(

)(2)酶的活性受溫度、pH和酶用量等因素的影響(

)提示酶用量不影響酶的活性。(3)果膠起著將植物細胞粘合在一起的作用，它溶于乙醇(

)提示果膠不溶于乙醇。(4)用固定化α-淀粉酶進行淀粉水解實驗時不需考慮溫度(

)提示溫度影響酶的活性。(5)固定化α-淀粉酶可永久使用(

)提示固定化酶能夠重復使用，但不是永久使用。√××××(6)α-淀粉酶固定化實驗結束后，將固定化柱放在常溫下即可(

)提示固定化柱應低溫保存。(7)固定化酶是通過物理或化學的方法將非水溶性的酶固定在某種介質上，使之成為可重復使用的酶制劑(

)(8)鑒別果膠最簡便的方法是加入95%的乙醇(

)(9)果膠酶常存在于動物細胞，用于消化纖維素等營養成分(

)(10)制備固定化酶柱時，用10倍體積蒸餾水洗滌的目的是洗去未吸附的α-淀粉酶(

)××√×√03熱點考向探究REDIANKAOXIANGTANJIU考向一考查微生物的利用1.(2019·浙江名校協作體高三聯考)請結合以下酵母菌在人類生產生活中的實際應用，回答下列問題：(1)為了篩選出符合要求的酵母菌，科研人員在培養基中添加了青霉素，其目的是_____________；為了將分離到的菌株純化，挑取了菌落在3塊相同的平板上劃線，以獲得單菌落。下圖所示的劃線分離操作中，正確的是___。科研人員發現其中一塊平板的各劃線區均未見菌生長，最可能的原因是__________________________。1234抑制細菌生長B接種環溫度過高，菌被殺死解析為了篩選出符合要求的酵母菌，科研人員在培養基中添加了青霉素，其目的是為了抑制細菌的生長。劃線分離操作中，下一次劃線要在上一次劃線末端處開始。若其中一塊平板的各劃線區均未見菌生長，最可能的原因是接種環溫度過高，菌被殺死。1234(2)釀酒和制醋是古老的生物技術，與此生產有關的微生物分別是酵母菌和___________。以果汁為原料經發酵制作醋的過程中，首先酵母菌在無氧條件下進行酒精發酵；然后相關菌種在_____條件下將上述發酵產物轉變為醋酸。1234醋化醋桿菌有氧解析與釀酒和制醋有關的微生物分別是酵母菌和醋化醋桿菌。以果汁為原料經發酵制作醋的過程中，首先酵母菌在無氧條件下進行酒精發酵；然后醋化醋桿菌在有氧條件下繼續將上述發酵產物轉變為醋酸，醋化醋桿菌是好氧生物。2.(2019·浙江超級全能生9月聯考)食品安全國家標準中有奶粉可能含有的細菌克羅諾桿菌屬(阪崎腸桿菌)的檢測標準，其流程如圖，請回答：注釋

a.一般奶粉中含有的細菌較少，BPW屬于增菌培養基。b.mLST－Vm培養基：氯化鈉、胰蛋白胨、乳糖、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、十二烷基硫酸鈉、蒸餾水、萬古霉素。c.克羅諾桿菌屬及少數其他細菌能在③顯色培養基上呈現較淺的藍綠色。d.TSA培養基：胰蛋白胨、植物蛋白胨、氯化鈉、蒸餾水等。e.克羅諾桿菌屬還有許多生化指標需要精細鑒定，最終生成報告。1234(1)過程中的BPW培養基為______(填“固體”“液體”或“半固體”)培養基。1234液體解析BPW培養基為增菌培養基，即用于擴大培養，為液體培養基。(2)②選擇培養時，mLST－Vm培養基中添加的萬古霉素是一種抗生素，分析可得，克羅諾桿菌屬對該抗生素________(填“敏感”或“不敏感”)。1234不敏感解析本實驗的最終目標是篩選出克羅諾桿菌屬，因此步驟②中的萬古霉素需要將克羅諾桿菌屬保留下來，并盡可能多地殺滅其他雜菌，因此克羅諾桿菌屬對萬古霉素不敏感。(3)由于②的培養產物細菌濃度未知，為避免對其進行稀釋的工作，從②轉移至③培養時，需采用的接種方法為____________。③過程所需的顯色培養基在制備時的次序是________。A.調節pH

B.稱量藥品C.溶解D.倒平板E.滅菌1234劃線分離法BCAED解析檢測樣品中細菌數量不確定，經過①②培養后，菌液中的密度大小不確定，若采用涂布分離法，需要一個合適的稀釋濃度，這樣不符合題意，因此可采用劃線分離法，接種環在平板上劃線到末端時，一般可形成單菌落；制備培養基的流程為BCAED。(4)克羅諾桿菌屬能產生黃色素，積累到一定量的時候，可使整個菌落呈現黃色，故TSA培養后要挑取黃色菌落，除注釋中的成分外，TSA培養基中還應包含_______________。1234瓊脂(或瓊脂糖)解析在TSA培養基上要挑取菌落，可見TSA培養基是固體培養基，因此在配方中還應添加瓊脂或瓊脂糖。(5)食品安全關系每個人的生命，對一種細菌的鑒定程序也相當嚴格。在上述檢測程序中，步驟__________________(填序號)對克羅諾桿菌屬具有一定的選擇或鑒定作用。1234②③④⑤(缺一不可)解析國家安全標準相當嚴格，上述流程中的②③④⑤在一定程度上都對克羅諾桿菌屬進行選擇或鑒定，以確保檢測的準確性。考向二考查酶的利用3.(2019·浙江4月選考節選)回答與果膠和果膠酶有關的問題：(1)通常從腐爛的水果上分離產果膠酶的微生物，其原因除水果中果膠含量較高外，還因為___________________________________。(2)為了獲得高產果膠酶微生物的單菌落，通常對分離或誘變后的微生物懸液進行____________________。(3)在某種果汁生產中，用果膠酶處理顯著增加了產量，其主要原因是果膠酶水解果膠使___________________________。果汁生產中的殘渣果皮等用于果膠生產，通常將其提取液濃縮后再加入___________使之形成絮狀物，然后通過離心、真空干燥等步驟獲得果膠制品。1234腐爛的水果中含產果膠酶的微生物較多涂布分離(或劃線分離)水果組織軟化疏松及細胞受損95%乙醇(4)常用固定化果膠酶處理含果膠的污水，其主要優點有______________________和可連續處理等。在建立和優化固定化果膠酶處理工藝時，除考慮果膠酶的活性和用量、酶反應的溫度、pH、作用時間等環境因素外，還需考慮的主要有_____________和_________________。1234提高果膠酶的穩定性固定化的方法固定化所用的介質4.(2019·浙江麗衢湖9月聯考)回答下列“果汁中的果膠和果膠酶”的相關問題：(1)自制的果汁很渾濁，主要是含有大量雜質，雜質的主要