外源性VEGF誘導的大鼠視網膜血管病變【摘要】目的：探討外源性VEGF誘導的大鼠視網膜血管病變的特點。方法：大鼠120只隨機分為正常對照組、rrVEGF164低、高濃度組。不同時間行熒光素眼底血管造影、視網膜電圖振蕩電位、組織學檢查。結果：高濃度組注射rrVEGF164眼從注射后10d表現為眼底后極部視網膜動脈局限性高熒光，2wk時表現為單個視網膜內核層毛細血管管腔窄小，內皮細胞肥大,管腔面積和細胞面積分別與自身對照眼、4，6wk比較，差異有顯著性。視網膜電圖OPs總波幅2，6wk降低，分別與自身對照眼、4wk比較，差異有顯著性。結論：高濃度高頻率注射rrVEGF164誘導的大鼠視網膜血管病變主要表現有視網膜水腫，大血管擴張，內核層毛細血管管腔變窄、接近閉塞，內皮細胞肥大、增生，周邊部玻璃體視網膜纖維血管樣膜。

【關鍵詞】視網膜毛細血管

0引言

VEGF是最重要的促血管形成因子，組織缺血、缺氧是VEGF的啟動因素。缺血性眼病的視網膜、視網膜下新生血管膜等均有VEGF的表達，眼內VEGF濃度明顯升高[1]。目前有關VEGF的研究大多是離體拮抗外源性VEGF或在體拮抗內源性VEGF的藥物抑制實驗，而單獨應用外源性VEGF進行動物實驗，探討VEGF誘導的視網膜血管病變的特點，國內外研究甚少。我們探討外源性VEGF誘導的視網膜血管病變的特點，為進一步研究藥物拮抗VEGF打下基礎。

1材料和方法

材料Sprague-Daweley大鼠120只隨機分為3組：正常對照組36只，不作眼內注射。VEGF低濃度組36只，實驗眼每次注射濃度為10mg/L的rrVEGF1644μL，自身對照眼注射等量的/LPBS。兩眼均為隔天1次，共2次。VEGF高濃度組48只，實驗眼每次注射濃度為100mg/L的rrVEGF1644μL，自身對照眼注射等量的/LPBS。兩眼均為隔天1次，共4次。分別于2，4，6wk時均作眼底檢查后各隨機選取6只作眼底熒光血管造影、6只作視網膜電圖振蕩電位檢查，再各隨機抽取6只處死作組織學切片、6只處死作透射電子顯微鏡觀察。VEGF高濃度組剩余12只于12wk時處死，隨機選取各6只行組織學切片、透射電子顯微鏡檢查。Topcon眼底照相機，視覺電生理診斷儀，正方測試格，玻璃毛細管，重組大鼠血管內皮生長因子，FITC-Dextran。

方法大鼠充分散瞳后，30g/L戊巴比妥鈉溶液ip麻醉。結膜囊表面麻醉，眼科手術顯微鏡下用30#B-D針頭于背側角膜緣后1mm處刺穿眼球壁后立即出針，角膜緣行前房穿刺，消毒剪刀將自制玻璃體腔微量注射針針尖剪去，暴露開口。10μL加樣移液器抽取rrVEGF164或PBS4μL注于消毒的點樣紙上。自制玻璃體腔微量注射針立即吸取。沿預先穿刺好的針孔處以45～50°的角度進入眼內并緩慢注射，停留約15s后拔針。術眼涂眼膏，術后3d用3g/L諾氟沙星滴眼液滴眼，2次/d。注射rrVEGF164或PBS前、后，出現玻璃體出血者不納入實驗對象。散瞳后，ip麻醉大鼠，結膜囊表面麻醉。暗適應30min，暗紅光下安放3個電極，小號銀針柄端連接于電極線末端后，角膜電極插于上方周邊部角膜基質層，參考電極置于兩眼連線的中點皮下，地電極置于同側耳根皮下，黑色膠紙遮蓋未檢查眼。根據國際臨床視覺電生理學會制定的視覺電生理標準化方案，設定刺激參數,雙眼分別記錄視網膜電圖振蕩電位(electroretinographicoscillatorypotentials,ERG-OPs)。散瞳后眼底熒光血管造影，鼠尾靜脈注射50g/LFITC-Dextran，固定動物，注射造影劑后5s，各個方位眼底照相，每次拍片間隔5～10s，持續3min，選擇性拍片直至注射造影劑50min。剝離視網膜，常規電鏡制片，每只大鼠每眼隨機觀察2個銅網，每個銅網隨機照相2張。同一組、同一眼別的樣本分散，使各組樣本容量達24張。對視網膜內核層單個毛細血管管腔面積、血管內皮細胞面積進行形態計量，采用正方測試格計數法測量視網膜內核層單個毛細血管管腔面積、血管內皮細胞的面積。

統計學處理：所有數據均用均數±標準差表示，采用SPSSforWindows統計軟件處理。資料正態檢驗，方差齊性檢驗后，單因素方差分析，兩因素方差分析，P＜為統計學差異有顯著性。

2結果

直接眼底鏡觀察注射rrVEGF164眼低濃度組在注射后1d表現為玻璃體腔輕度混濁，隨后逐漸減輕，至3d恢復透明。高濃度組在注射后1d表現玻璃體中度混濁，5～6d后玻璃體腔恢復透明。約10d表現為眼底后極部大血管輕度結節樣擴張，周圍視網膜輕度水腫，2wk時重度擴張，4wk時有所加重。6wk時與4wk時相比無明顯變化。12wk時玻璃體腔出現纖維組織增生，眼底模糊不清。注射PBS眼無玻璃體混濁，低濃度組和注射PBS眼未出現結節樣擴張和視網膜水腫。

眼底熒光血管造影高濃度組注射rrVEGF164眼視網膜中央動脈約11s開始充盈，灌注時間較正常組延長。注射rrVEGF164后10d表現為眼底后極部視網膜動脈局限性高熒光，熒光素從中央區開始消退。2wk時呈結節樣擴張，隨時間延長而明顯，6wk時與4wk時比較無明顯加重。未見視網膜前新生血管滲漏征象。3mo時玻璃體腔纖維血管樣組織增生，眼底觀察困難，未行造影檢查。

組織學觀察光鏡下低濃度組可見視網膜水腫，各個層次厚度無明顯變化。未見突破視網膜內界膜的血管內皮細胞。高濃度組10d時輕度視網膜水腫，2wk時視網膜水腫加重，6wk時視網膜內界膜不完整，視網膜前纖維組織樣增生，12wk時在眼底周邊部玻璃體視網膜纖維血管樣組織增生。透射電鏡顯示正常大鼠視網膜內核層毛細血管內皮細胞呈扁長形，細胞核較大，突入毛細血管管腔內。胞質稀少，含有高爾基體、線粒體、粗面內質網等超微結構。高濃度組實驗眼2wk時表現為視網膜內核層單個毛細血管內皮細胞肥大、管腔面積變窄，4wk與6wk時血管管腔、細胞面積恢復正常，但是6wk時血管內皮細胞增生明顯。12wk血管內皮細胞增生，毛細血管接近閉塞。內核層單個視網膜毛細血管管腔面積和單個視網膜毛細血管內皮細胞面積經配伍設計兩因素方差分析，注射rrVEGF164眼同一濃度不同時間各組間比較：100mg/L組差異有顯著性，單個視網膜毛細血管管腔面積F＝，P＝。進一步用多個樣本均數q檢驗，4wk與6wk組差異無顯著性，P＝，2wk組與4wk組，2wk組與6wk組差異有顯著性。單個視網膜毛細血管內皮細胞面積F＝，P＝。進一步用多個樣本均數q檢驗，4wk組與6wk組比較差異無顯著性，P＝，2wk組與4wk組，2wk組與6wk組差異有顯著性(表1)。

視網膜電圖振蕩電位總波幅經配伍設計兩因素方差分析，同一濃度不同時間各組間比較：100mg/L組差異有顯著性，F＝，P＝。進一步用多個樣本均數q檢驗，2wk組與6wk組比較，差異無顯著性，P＝。2wk組與4wk組，6wk組與4wk組差異有顯著性。

3討論

玻璃體腔注射的量過低，玻璃體腔藥物濃度、藥物在玻璃體內的彌散受影響。Dureau等研究發現注射量為3μL或者5μL具有丟失量少、可重復性等優點。而Hayashi等的經驗是：對200～250g的白化病大鼠注射玻璃體的液體量的原則是最大量不超過玻璃體容積的10%。綜合考慮，本實驗選擇大鼠玻璃體腔內注射rrVEGF164的體積為4μL，前房穿刺可防止注射后眼壓升高。高分子量右旋糖苷標記的熒光素不會從血管內漏出，背景熒光很低。為了比較清晰的顯示視網膜血管病變，不遺漏可能出現的早期新生血管，我們選擇50g/LFITC-dextran1mL鼠尾靜脈注射眼底血管造影，大鼠視網膜血管系統顯示清晰。正常大鼠眼底熒光血管造影與人眼比較，具有灌注時間短、熒光素完全消退時間延長等特點。我們推測可能與大鼠體表面積少、高分子量的右旋糖苷標記物使熒光素衰減慢有關。

研究糖尿病視網膜病變時最常用的指標是振蕩電位各子波波幅的總和。實驗中我們誘導的早期視網膜血管病變在一定程度上類似于糖尿病性視網膜病變的早期改變,但未發現明顯的視網膜缺血無灌注區域。可能有如下原因：VEGF的濃度和刺激時間不足；極周邊部視網膜即使出現上述病變，造影時的角度、動物麻醉時的眼位固定狀態也可能影響造影時觀察，難以發現。實驗結果顯示高濃度組2wk時視網膜內核層血管內皮細胞肥大，血管管腔面積減少。我們推測這種改變影響組織的血液供應，導致視網膜的缺血。因此可能引起的OPs改變先于a，b波的改變。因此我們選擇OPs的總波幅作為觀察指標。結果顯示高濃度組2wk時SAOPs降低，說明血管內皮細胞肥大，毛細血管管腔變窄導致了視網膜缺血。

VEGF作為一種重要的促進新生血管形成因子，已被人們所認識。VEGF的明膠微球置于獼猴的視網膜下后，視網膜下新生血管的形成率為92％。Alikcacem等將VEGF緩釋裝置置入兔的玻璃體腔，誘導的視網膜病變與增殖性糖尿病視網膜病變類似。Tolentino等認為VEGF誘導的獼猴視網膜出血、水腫、靜脈串珠、毛細血管閉塞、微血管瘤、視網膜內血管組織增生等視網膜病變類似于糖尿病性視網膜病變和其他缺血性視網膜病變。采用ADPase染色的方法，證明周邊部眼底存在視網膜前新生血管。VEGF誘導猴視網膜血管內皮細胞肥大亦有報道。本研究顯示：低濃度作用，玻璃體視網膜血管病變不明顯。高濃度短時間作用可以誘導視網膜內核層毛細血管內皮細胞肥大，管腔面積減少。高濃度較長時間可以誘導血管內皮細胞增生。高濃度長時間作用可以出現視網膜內血管內皮細胞增生，管腔面積接近閉塞，玻璃體視網膜纖維血管樣組織。但是，在高濃度作用4wk時，誘導的病變僅限于視網膜血管曲張，視網膜內核層的毛細血管管腔、血管內皮細胞未出現變化。我們推測在rrVEGF164作用2wk至6wk之間，也就是血管內皮細胞從肥大到增生的演變過程中，存在某種更替機制。可能在2wk時外源性的rrVEGF164對血管內皮細胞處于作用階段，表現為細胞代償性肥大。在4wk時玻璃體腔外源性的rrVEGF164的濃度不足以再起刺激作用。在6wk或更晚期階段，在先期階段外源性的rrVEGF164作用下，內源性的機制被啟動，而表現為血管內皮細胞增生，甚至玻璃體視網膜纖維血管樣組織增生。

產生視網膜前新生血管，必須要有足夠強度的刺激因素，而且要具備足夠的刺激時間。視網膜層間的血管內皮細胞增殖可以認為是視網膜內新生血管形成的征象，但是這種新生血管因為相對靜止，不會產生滲漏等改變，因此不同于視網膜前、視網膜下的新生血管，它的臨床意義不大。我們推測早期的血管內皮細胞肥大，血管管腔面積減少，影響視網膜局部血液供應，視網膜水腫，局限性缺血、缺氧，導致視網膜功能發生改變，視網膜電圖振蕩電位總波幅降低。但是rrVEGF誘導的這種視網膜血管內皮細胞肥大的確切原因、病理意義，視網膜血管內皮細胞形態、數目的動態變化有待更深層次的研究。

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