細菌的耐藥機理及檢測方法第一頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三隨著抗生素的廣泛大量的濫用、介入性治療、免疫抑制劑應用及某些基礎疾病的發生。細菌性感染已是臨床重要的常見病，且耐藥性和耐藥水平越來越高，給疾病的治療及臨床用藥造成諸多困難。病原菌對常用抗生素，如β-內酰胺類、氨基糖甙類和喹諾酮類藥物的耐藥性尤為突出，及時了解細菌的耐藥機制和抗生素的發展及應用對策，對我們預防和治療細菌性感染、制備新的抗菌藥物及控制耐藥性的蔓延是非常重要的。第二頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三藥物作用機制落后于細菌對抗生素耐藥性傳播的發展，藥物作用機理主要是通過干擾細菌核酸的合成、抑制核糖體的功能、抑制胞壁的合成及葉酸鹽的代謝等。細菌對抗生素的耐藥機制包括遺傳和生化兩種方式：<1>遺傳方式包括固有耐藥（天然性）和染色體突變產生的耐藥或獲得新的DNA分子；<2>生化方式是指細菌獲得性耐藥或質粒介導的耐藥，主要包括：產生B-內酰胺酶、乙酰基轉移酶、腺甘酸酶、磷酸化酶、拓撲異構酶等對藥物的滅活作用；依靠菌膜的特性降低藥物的通透性；改變抗生素作用的靶位，縮短與藥物結合的時間；產生藥物代謝的旁路；大量產生青霉素結合蛋白（PBPS），降低抗生素的新生力；發展產生耐受；產生抗生素導出泵。第三頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三

遺傳方式固有耐藥固有耐藥具有種屬特異性，來源于該細菌固有的自然特性，即本身具有耐藥基因存在染色體上，非發酵的G-桿菌如綠膿稈菌、醋酸鈣不動桿菌、假單胞菌屬及大多數G-桿菌耐萬古霉素和甲氧西林，腸球菌耐頭孢菌素，厭氧菌耐氨基糖甙類藥物等，這些菌的高度固有耐藥性是由于菌體外膜的通透性低與繼發的雙重耐藥機理（誘導產生頭孢菌素酶和抗生素導出泵）導致的。第四頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三染色體突變或獲得新的DNA分子突變可發生于DNA分子，如結核桿菌的點突變可導致對利福平的耐藥，淋球菌的點突變可導致對苯唑西林的耐藥；也可發生于質粒和轉座子的基因上，如質粒編碼產生的超廣譜B-內酰胺酶（ESBL）可能由于TEM和SHV酶基因的點突變導致的，這些點突變集中于基因的5個區域內，殘基的突變能改變B-內酰胺酶與頭孢菌素的結合形成，消除阻遏作用，導致抑制和水解三代頭孢菌素，如果酶基因的連續突變可從本質上增強酶的活力，使新一代頭孢菌素滅活；某些DNA調節區基因的突變可產生頭孢菌素酶導致對第三代頭孢菌素耐藥。第五頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三耐藥性可通過接合、轉導和轉化在微生物間傳遞，外源性相關的DNA小片段組合為內源性基因幾乎都通過自然轉化和重組形成，質粒接合傳播的方式最普遍，但宿主范圍局限，尚未發生可在G+和G-菌中都能復制的質粒，而轉座子的宿主范圍較廣，可在G+和G-菌間轉移，如染色體內的AmpC基因可通過轉座子越位至質粒中，使某些細菌獲得誘導產生能力極強的I型酶，稱之為AmpC型ESBLS株（如腸球菌、克雷伯氏菌、某些腸桿菌科的細菌），是耐藥性傳播的重要原因之一。第六頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三

生化方式細菌獲得性耐藥的生化機理主要有以下幾種。1.酶的滅活作用通過水解或修飾作用破壞抗生素的活性。（1）β-內酰胺酶質粒介導或染色體突變使細菌產生β-內酰胺酶，可水解破壞β-內酰胺酶，使B-內酰胺類抗生素失活，這是大多數致病菌對此類抗生素產生耐藥性的主要機制。目前B-內酶胺酶已有230余種，包括TEM系列酶、SHV系列酶、OXA系列酶、PSE系列酶、頭孢菌素酶等，質粒介導的酶在G-菌中分布較廣，以TEM-1最普遍，其次為OXA-1。第七頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三根據分子量、等電點、被抑制譜、對底物的水解譜等將B-內酰胺酶又分為4類，Ⅰ類酶由染色體的AmpC基因誘導產生，多種需氧G-桿菌（如大腸桿菌、弗氏枸櫞酸桿菌、陰溝桿菌等）可產生此酶；Ⅱ類酶臨床上最為重要，分5個亞類（2a、2b-2b’、2c、2d、2e），大多數G+菌產生的酶（如pc1）屬于2a亞類，2b亞類（如SHV-1、TEM-1），2b’亞類（如TEM-3、SHV-2），2c亞類（如PSE-1，PSE-4）,2d亞類（如OXA-1和PSE-2），2e亞類（如FEC-1）少見，由大部分G-菌產生。隨著新的β-內酶胺類抗生素的臨床應用，由大部分G-菌產生。第八頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三隨著新的β-內酶胺類抗生素的臨床應用，新的酶類不斷產生，近年報道的ESBL可能來源于TEM和SHV酶，由于其有有序列的基因點突變導致的，該酶最早發現于肺炎克雷伯氏菌中，僅局限于少數腸桿菌和腸球菌中，可水解頭孢菌素及單酰胺類抗生素，特別表現為相應的產酶菌對頭孢噻肟、頭孢他啶和氨曲南的耐藥，并可引起對其氨基糖甙類抗生素的耐藥。第九頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三新近研究發現，過量產TEM和SHV型酶的的細菌具有含鋅的β-內酶胺金屬酶，此酶的催化效率極高，不僅存在于窄食假單胞菌中，也偶見于其它細菌，此酶對碳青霉烯類抗生素也有耐藥性，且不易受酶抑制劑的影響。β內酰胺酶陽性的嗜血桿菌屬、淋球菌和卡他莫拉菌對青霉素、氨芐西林和阿莫西林耐藥；β-內酰胺酶陽性的葡萄球菌和腸球菌對青霉素和乙酰氨基青霉素、羧基青霉素和脲基青霉素耐藥。注：只對嗜血桿菌屬，淋球菌，卡那莫拉菌、葡萄球菌和腸球菌測定β-內酶胺酶，不要對腸桿菌科，假單胞菌屬及其他需氧G-桿菌進行此試驗。第十頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三（2）ESBLs1983年由khothe在德國發現，1985年正式報道，該酶為絲氨酸蛋白酶的衍生物，它是由于β-內酰胺酶上1～4位點氨基酸發生了突變，并可以通過質粒傳播，由質粒介導的耐藥比由染色體介導的耐藥多，它可在不同菌株、菌種或菌屬間轉移擴散。突變產生的ESBLs抗藥性廣，且在ESBLS的質粒上常攜帶對其它抗生素如氨基糖苷類及氟喹諾酮類的耐藥基因，呈多重耐藥性。第十一頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三ESBLS的分類：根據酶的來源可分為TEM系列：為TEM1、TEM2的突變酶，此系列酶等電點一般介于5.1~6.5，絕大多數酶分子量（MW）為29KD，從TEM3起已發現有TEM-70，而且還在增加；SHV系列：此系列酶的等電點較高，介于7.0~8.2，分子量主要為29KD，從SHV-2起，現已發現SHV-12；非TEM和SHV系列。如確認為ESBLs菌株，不管體外藥敏試驗的結果如何，對所有青霉素類、頭孢菌素類和氨曲南均應報告耐藥。此酶對酶的抑制劑如克拉維酸、舒巴坦、他唑巴坦抑制。第十二頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三（3）AmpC酶：1976年開始研究，但直到1990年由PaPaniColaoll等才首先證實了此酶的存在。由染色體介導的AmpC酶已發現50多種，基因帶有調控序列，呈誘導型表達，酶的活性不被克拉維酸、EDTA抑制，可被鄰氯西林、頭孢西丁、BRL-42715、RO47、RO48等抑制劑抑制。攜帶染色體型AmPC基因的細菌主要有腸桿菌科、不動桿菌屬、綠膿桿菌等，根據產酶水平的高低和表達方式可分為：野生型，通常所定義的AmpC酶屬于此型；基礎型、低水平非誘導型表達，臨床定義不大，如E.Coli的染色體型AmpC酶；高誘導型，誘導后的產酶水平遠高于野生型；去阻遏突變型，持續或半持續高水平產酶。第十三頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三由質粒介導的酶可分5～6組：弗氏枸櫞酸桿菌組有LAT型和某些CMY型，腸桿菌屬有MIR-1型和ACT-1型，摩根摩根組有DHA-1型和DHA-2型，氣單胞菌組有MOX型、FOX型和其他CMY型等。質粒上的AmpC酶基因大小從7～180kb。酶分子大小約38～42KD，具有378～386個氨基酸。高產AmpC酶細菌通常對第四代頭孢菌（如頭孢吡肟）敏感，對碳青霉烯類敏感，對頭霉素類（如頭孢西汀）耐藥，不被酶抑制劑所抑制。如果分離的菌株對三代頭孢菌素耐藥，且不能被克拉維酸抑制、對泰能敏感、對頭孢西汀耐藥可初步推斷為高產AmpC酶的細菌。第十四頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三（4）氨基糖甙類滅活酶雙功能的氨基糖甙類滅活酶（6’-N-氨基糖甙類乙酰轉移酶，2’’-O-氨基糖甙類磷酶轉移酶）是葡萄球菌和腸球菌高水平耐氨基糖甙類藥物的重要機制。此酶在分子不同的區域內存在兩種不同的氨基糖甙改造因子，是由Th4100轉座子內6’-aac-a-2’’基因編碼合成，該基因可插入R質粒及氨基糖甙類抗生素染色體基因中，導致在G+菌中氨基糖甙類抗性的快速傳播。這種雙功能酶與其它抗生素抗性因子無任何基因關聯，真核蛋白激酶抑制劑能抑制磷酸轉移酶的活性，提示這種雙功能酶可能是蛋白質家族中的兩種普通結構，為臨床提供開發這種功能酶抑制劑的可能。第十五頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三（5）乙酰基轉移酶某些細菌（如金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腸球菌、肺炎球菌及流感嗜血桿菌等）對氯霉素耐藥性主要是由于質粒編碼產生的乙酰基轉移酶所致，該酶使氯霉素轉化為無活性的代謝產物，失去抗菌活性。第十六頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三（6）拓撲異構酶該酶又稱DNA旋轉酶，由gyrA和gyrB編碼，基因的突變引起靶酶DNA旋轉酶的改變，使喹諾酮類藥物失去抑制此酶的活性，而使細菌獲得耐藥。基因的突變常位于60-106殘基區域內，在大腸桿菌中約為第83個絲氨酸，金黃色葡萄球菌中為第84個絲氨酸。第十七頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三2.菌膜通透性的改變由于藥物的作用，細菌改變了外膜蛋白，使菌體外膜通透性降低，阻礙抗生素進入細菌內膜靶位。外膜通透性降低主要由于膜孔蛋白缺陷、多向性突變、特異性通道的改變及膜脂質雙層的改變。常見于假單胞菌、醋酸鈣不動桿菌、腸球菌等對B-內酰胺類、氨基糖甙類、氯霉素、喹諾酮類抗生素的耐藥。第十八頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三3.改變抗生素的作用靶位細菌在抗生素的作用下通過產生誘導酶對菌體成分進行化學修飾，使其與抗生素結合的有效部位變異，使藥物不敏感，而細菌的生理功能正常。常見的藥物有甲氧芐胺嘧啶、磺胺類、氨基糖甙類、氯霉素、喹諾酮類藥物。如DNA中A位點基因的突變導致回旋改變造成喹諾酮類耐藥；核糖體RNA甲基化抑制紅霉素結合；PBP的改變導致對B-內酰胺類抗生素的耐藥，PBP的改變主要有PBP數量改變或缺失、藥物與PBP的結合力降低、細菌產生誘導型PBP或緩慢結合的PBP。第十九頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三這種由PBP介導的耐藥性在G+菌中較G-菌更常見，最常見于耐甲氧西林的葡萄球菌，主要與PBP2a的存在有關，該蛋白是一種轉肽酶，負責細胞壁的合成，且由mecA基因編碼，位于DNA外區域mec內，受質粒攜帶的blaRI-blaI誘導抑制子及mecRI-mecI基因所編碼的蛋白質調控的，在抗生素的治療中，mecA基因編碼產生OXA系列酶，誘導表達產生大量的PBP，使藥物不易與胞壁結合，導致藥物的作用降低或失活。第二十頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三4.產生藥物代謝的旁路抗生素可與靶位結合，但靶位的生理作用已被某種新生成份代替，如G+菌耐灰黃霉素的機制可能與其產生旁路有關。第二十一頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三5.產生耐受對β-內酰胺類殺菌效應的耐受發生在抗生素低濃度時，細菌的生長狀態被抑制，需很高濃度才能將其殺滅，呈最低仰菌與最低殺菌濃度分離，這是由于細菌過度分泌自溶抑制因子而降低了細菌的自溶性，這種耐受性表現為細菌雖不對B-內酰胺類抗生素耐藥，但仍不被殺滅，致使抗生素治療效果不佳，噬菌體可能與非耐受性轉化有關，但其轉染機理不明。第二十二頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三6.產生導出泵導出泵的產生是受流出基因控制的，此基因存在于質粒上，在G-腸桿菌中該基因受抑制子調控，在G+菌中此基因受減毒機制調控，如G+菌對四環素的耐藥性主要是導出泵的建立和核糖體的保護作用，至少有一種核糖體保護基因受減毒機制調控，且其耐藥流出基因可以在不同的細菌間傳遞。與核糖體保護性相關的基因既存在于質粒上，也存在于染色體的共軛轉座子上，該轉座子最初發現于鏈球菌中，可轉染給其它G+菌、G-菌及支原體，四環素耐藥基因和基因的刺激轉導對其它受體菌來說具有雙重效應。第二十三頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三另外，G-桿菌導出泵的建立，易造成多重耐藥，已發現旋轉酶突變與導出性耐藥機制共同存在，多重耐藥機制在同一菌株中同時產生，容易產生對藥物的高度耐藥。7.超級整合子(基因盒)

銅綠假單胞菌對碳青酶稀類的泵出機制：美平/泰能(MIC)≥1占17.6%。(國外15%-35%)。

超級整合子（耐藥基因盒）：10.26%。第二十四頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三耐藥篩選第二十五頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三耐藥篩選第二十六頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三細菌耐藥的主要機制抗生素靶位點改變,孔蛋白改變，細胞壁/膜通透性改變,超級整合子(基因盒)產生滅活酶第二十七頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三新的耐藥細菌突變XX耐藥細菌的擴散敏感細菌耐藥細菌耐藥基因轉移第二十八頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三耐藥細菌感染的后果細菌耐藥的直接后果增加患者住院時間與住院率增加死亡率增加感染發病率(MRSA,VRE,ESBL)增加醫療費用抗生素后時代間接后果無法治療的感染對生產力損失估計美國每年損失：$40億美圓第二十九頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三關于藥物的幾個概念（1）抗感染藥物（anti-infectiveagents）”包括用以治療各種病原體（病毒、衣原體、支原體、立克次體、細菌、螺旋體、真菌、原蟲、蠕蟲等）所致感染的各種藥物“（2）抗微生物藥物（anti-micyobial）較抗感染藥物略窄，抗蠕蟲藥物一般不包括在內（3）抗生素（antibiotics）：在高稀釋度下對一些特異微生物有殺滅或抑制作用的微生物產物。以后將用化學方法合成的仿制品，具有抗腫瘤、寄生蟲等作用的微生物產物，以及抗生素的半合成衍生物等也統稱為抗生素。但非微生物產物的全合成藥物如喹諾酮類、咪唑類等不應列入抗生素。（4）抗菌素（antibacterial）：此名稱現已摒棄不用（5）抗菌藥物（antibacterialagents）：指具有殺菌或抑菌活性，主要供全身應用（含口服、肌注、靜注、靜滴等，部分也可用于局部）的各種抗生素、磺胺藥、異煙肼、咪唑類、硝咪唑類、喹諾酮類、呋喃類等化學藥物。（6）化學治療藥（chemotherapeuticagents）：應用于臨床上一切具有化學結構（含尚未闡明者）的藥物統稱。第三十頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三

對當前臨床上面臨嚴峻的細菌耐藥性及其發展，耐藥性從G-桿菌發展到G+球菌，由院內感染發展到院外感染。對耐藥菌感染的治療尚無可靠的藥物，對預防和控制耐藥菌的出現和傳播尤為重要，我們應采取積極有效的措施來保護人類的健康。控制細菌耐藥性的對策主要有：<1>加強對已出現的耐藥菌進行動態耐藥性監測，爭取及早作出病原學診斷，有針對性選擇抗生素；<2>加強和嚴格執行消毒隔離制度，尤其是在耐藥菌嚴重感染的重癥監護病房等單位，防止交叉感染；<3>合理應用抗生素，嚴格掌握用藥原則。第三十一頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三

從目前來看，通過研究新的抗生素和消除細菌耐藥性基因來控制細菌耐藥性還未取得令人滿意的進展，因此對抗生素的使用進行宏觀管理與控制是減少耐藥性產生的重要措施，如盡量減少青霉素的預防性應用，控制第三代頭孢菌素及其它新的B-內酰胺類、氟喹諾酮類藥物的大量應用，根據臨床細菌藥敏感結果、患者自身感染狀況合理選擇抗生素聯合應用；〈4〉研制新的抗生素，對產酶菌開發新型穩定的制劑，如對青霉素和頭孢菌素用取代基替代6-氨基青霉烷酸或7-氨基頭孢烷酸的氨基酸組，或用a-甲氧基替代青霉素中的6碳和頭孢菌素中7碳上的氫，對羧芐青霉素可結合一個6-氫氧基組分，使抗生素增強B-內酰胺酶的水解能力。第三十二頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三

開發G+球菌感染治療的有效藥物，如鏈陽菌素為原始霉素的衍生物，可與細菌核糖體50s亞基中的不同位點結合，抑制蛋白質的合成，達到殺菌的目的，該藥主要用于耐甲氧西林的葡萄球菌、鏈球菌、肺炎球菌及流感桿菌、奈瑟氏菌屬、卡他莫拉氏菌等感染的治療；甘氨酰環素為多四環素與米諾環素的半合成衍生物，對MRSA、MSSA、腸球菌、鏈球菌屬、肺炎球菌有強大的作用，對G-桿菌和厭氧菌亦有良好作用，可能成為治療多重藥菌感染的有效藥物；2-吡啶酮類藥物其結構與氟喹諾酮類相似，其抗菌譜廣，對各種G-桿菌、G+球菌及厭養菌均有良好的抗菌活性，可能適用于各種呼吸道、皮膚、軟組織及尿路感染，以及作為嚴重感染的經驗用藥；第三十三頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三惡唑烷酮類為全新的化學結構，以U-100592、U-100766為代表，與已知抗生素無交叉耐藥，對G+球菌有強大的殺菌作用，對厭養菌、結核桿菌也有良好作用，但對G-桿菌無作用，機理為作用于細菌蛋白合成的起始階段，抑制30s核糖體起始復合物的形成，該藥有望成為臨床治療耐藥性G+菌感染最有效藥物。<5>研究消除耐藥質粒。細菌的耐藥性大多由其質粒上的耐藥基因控制的，如能消除細菌中的耐藥質粒，則可降低細菌的耐藥性，到現在為止，國際上還沒有一個較好的可供體內使用的清除R質粒的方法，這方面研究的難度很大，但仍需繼續努力。<6>進一步深入研究細菌的耐藥機制，不斷更新防治耐藥菌的措施。第三十四頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三細菌的耐藥機理越來越復雜，不斷有新的耐藥機制出現，這是細菌與人類生命相互抗爭的較量，尚需人們付出艱苦卓絕的研究工作，逐步控制和減少細菌的耐藥性，以至最終消滅耐藥菌，使人類在和平美好的環境中健康快樂地發展。第三十五頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三附注：β-內酰胺酶的檢測:（1）頭孢硝基噻吩顯色法（Nitrocefin）：制配紙片→滅菌水濕潤→涂測試菌于紙片上，10min觀察紙片顏色，顯紅色為陽性（葡萄球菌應放置1h內觀察）。（2）酸度法：青霉素→β-內酰胺酶水解→青霉酸、pH6.8以下→酚紅指示劑由紅色（構櫞酸鈉緩沖液pH8.5）變為黃色。（3）碘測定法：β-內酰胺酶破壞β-內酰胺環，碘與破壞后的β-內酰胺結合，使蘭色的淀粉—碘復合物轉變成無色。（4）儀器測定法：Vitek-AMS、Microscan的藥物測試卡中均帶有測酯功能。第三十六頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三ESBLS檢測：（1）紙片擴散初篩：頭孢他啶（30μg/片）抑菌圈≤22mm頭孢噻肟（30μg/片）抑菌圈≤27mm頭孢曲松（30μg/片）抑菌圈≤25mm氨曲南（30μg/片）抑菌圈≤27mm（2）肉湯稀釋法：上述藥物MIC≥2μg/ml可疑為ESBLS。（表型確證試驗：對2個任何一個藥物MIC，在加克位維酸比不加克拉維酸的MIC值降低3個以上對倍稀釋度判為ESBLS）。第三十七頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三（3）雙紙片協同確認試驗：頭孢他啶（30μg/片）與頭孢他啶（30μg）/克位維酸（10μg）頭孢噻肟（30μg/片）與頭孢噻肟（30μg）/克拉維酸（10μg）兩紙片抑菌圈相比≥5mm即為ESBLS。（4）E-test法（濃度梯度法）：由瑞典ABBiodisk公司研究生產，廣洲貝肯公司經銷。試條中的三代頭孢菌素或氨曲南的MIC≥2μg/ml即可疑為ESBLS。第三十八頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三（5）儀器測定法：Vitek,microscan和BD-PHOEMXTM微生物分析儀均可測試ESBLS。（6）利用分子生物學技術（PCR、DNA探針等）及分析酶底物譜及抑制物譜、生物化學技術等檢測技術可對ESBLS做出確診。第三十九頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三Ampc酶檢測：（1）初篩：①頭孢西?。?0μg/片）與頭孢西?。?0μg）/鄰氯西林（200μg）。后者比前者的抑菌圈≥5mm即疑為Ampc。②5種紙片篩選：馬斯平、泰能、頭孢西汀、頭孢他啶與頭孢他啶/克拉維酸。如頭孢西汀≤18mm，對馬斯平、泰能敏感即疑為產Ampc，如頭孢他啶與其酶抑制劑的抑菌圈≥5mm可能產ESBLS。（2）確認試驗（頭孢西汀三維水相試驗法）第四十頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三一．金屬β-內酰胺酶的表型檢測方法(一)頭孢他啶+2-巰基丙酸法(CAZ+NCA)1.將待測菌株按常規藥敏紙片K-B法操作均勻涂布于M-H平板上。2.在M-H平板上分別貼兩片頭孢他啶(30ug/片)紙片，紙片中心相距2.5cm,將其中一片頭孢他啶紙片上加3ul2-巰基丙酸，35℃孵育18-24h。3.結果觀察：若加有2-巰基乙酸的頭孢他啶紙片抑菌圈大于單個頭孢他啶的抑菌圈（≧4mm），則為陽性，即產金屬β-內酰胺酶。第四十一頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三一．金屬β-內酰胺酶的表型檢測方法(二)亞胺培南+EDTA法(IMP+EDTA)1.將待測菌株按常規藥敏紙片K-B法操作均勻涂布于M-H平板上。2.在M-H平板上貼一片亞胺培南(10ug/片)紙片，在距亞胺培南紙片中心1.5cm處貼無菌空白紙片一片，將0.5MEDTA10ul均勻浸注于空白紙片上，35℃孵育18-24h。3.結果觀察：若兩片紙片抑菌圈有協同作用，則為陽性，即產金屬β-內酰胺酶。第四十二頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三二．AmpC酶新的檢測方法(一)三維水相試驗方法的改進1.將標準菌株ATCC25922按常規藥敏紙片K-B法操作均勻涂布于M-H平板上。2.在M-H平板中心貼一片頭孢西汀(30ug/片)紙片，在距紙片邊緣1cm處，用無菌手術刀片切3cm長度的小槽，將待測菌株的6個菌落接種于槽內(勿溢出槽外)，35℃孵育18-24h。